Después de recolectar tejido adiposo intermuscular humano homogeneizado en un tubo de baja unión de 1,7 mililitros en hielo, agregue 14 microlitros de Triton X-100 al 10% para homogeneizar. Incuba el tubo en la oscuridad sobre hielo durante 10 a 15 minutos mientras haces un vórtice cada tres minutos. En un tubo cónico separado de 15 mililitros, humedezca previamente un colador de celdas de 100 y otro de 40 micras con 100 microlitros de DPBS.
Filtre el homogeneizado a través de un colador de células de 100 micras. Enjuague un tubo de enlace bajo de 1,7 mililitros con 400 microlitros de tampón de homogeneización y filtre la suspensión a través de un filtro de células de 100 micras. A continuación, filtre la suspensión obtenida a través de un filtrado de 100 micras en un filtro de células de 40 micras.
Distribuya uniformemente la solución en dos tubos de baja unión de 1,7 mililitros preenfriados. Centrifugar los tubos a 2700 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Deseche la capa lipídica superior y el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros en el primer tubo.
Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces sin crear burbujas para volver a suspender el pellet en el primer tubo y transferir la suspensión a un nuevo tubo de enlace bajo de 1,7 mililitros. A continuación, añada 500 microlitros de medio de aislamiento de núcleos al tubo de baja unión de 1,7 mililitros y mezcle con el pipeteo. Centrifugar el tubo a 1000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros en el tubo y pipetee suavemente para volver a suspender el pellet. A continuación, añadimos 200 microlitros de medio de aislamiento de núcleos, y mezclamos la suspensión. Agregue una gota de la solución de tinción de células vivas e incube en la oscuridad sobre hielo.
Después de 15 minutos, filtre la solución a través de un colador de células de 30 micras. Mezcle la solución de núcleos y agregue 10 microlitros a un portaobjetos de la cámara de recuento de células. Cuente los núcleos utilizando un contador de células automatizado.
