Para comenzar, obtenga células THP-1 diferenciadas y retire el medio gastado de los pocillos de la placa de cultivo Después de lavar las células con PBS, agregue un medio sin suero que contenga lipopolisacárido, o LPS, a las células e incube la placa. A continuación, añada la solución madre de trifosfato de adenosina o ATP al grupo modelo e incube la placa durante 45 minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, aspire todo el sobrenadante de los pocillos de la placa de cultivo.
Después de lavar las células dos veces con PBS, agregue 500 microlitros de tripsina al 0,05% sin EDTA a cada pocillo e incube durante 30 segundos. Para detener el desprendimiento de células, agregue un mililitro de medio RPMI 1640 y transfiera las células a un tubo de cinco mililitros. Centrifugar el tubo a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente.
Después de volver a suspender las células en un mililitro de PBS, coloque el tubo con las células en un baño de agua a 37 grados centígrados durante tres minutos y centrifuga. Para volver a suspender las células, agregue 100 microlitros de tampón de unión 1X y transfiera las células a un nuevo tubo de cinco mililitros. Incubar los tubos de control y modelo con los reactivos adecuados en la oscuridad a temperatura ambiente.
Para finalizar la incubación, agregue 400 microlitros de PBS al tubo y vírtice suavemente. Filtre la suspensión celular en una malla de nailon de 35 micrómetros fijada a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Sumerja un cubreobjetos limpio en una solución de cromo y alumbre durante dos horas y séquelo en un horno a 37 grados centígrados.
Granular las células tripsinizadas como se demostró anteriormente, y fijar las células con 500 microlitros de fijador de microscopio electrónico durante dos horas a temperatura ambiente, seguidas de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Después de recoger las células de la solución fija, granulémoslas a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Agregue 100 microlitros de PBS y sople suavemente las células.
Deje caer la suspensión de la celda sobre un cubreobjetos y déjela reposar durante cinco minutos. Aspire todo el sobrenadante y lave las células tres veces con PBS durante cinco minutos cada una. Añadir 500 microlitros de solución de fijación de ácido ósmico al 1%.
Después de una hora, aspire todo el sobrenadante. Después de tres lavados con PBS, deshidrate las muestras en concentraciones crecientes de etanol. Encienda el secador de puntos críticos, abra el tanque de dióxido de carbono y enfríe la cámara a 10 grados centígrados.
Envuelva rápidamente la muestra con papel de filtro y colóquela en la cámara cuando la presión de la cámara sea de cero libras por pulgada cuadrada. Una vez que la temperatura se estabilice a 35 grados centígrados y la presión alcance 1.250 libras por pulgada cuadrada, despresurice a 100 libras por pulgada cuadrada por minuto. Extraiga la muestra cuando la presión de la cámara sea cero.
Finalmente, usando cinta conductora, monte las muestras en un microscopio electrónico de barrido, soportes de muestras de aluminio que emplean un codificador de pulverización catódica. Cubra las muestras con una capa de oro de dos a cinco nanómetros. El análisis de citometría de flujo mostró que después de la estimulación con LPS/ATP, las células en la región QT aumentaron significativamente, lo que indica la muerte celular.
Las micrografías electrónicas de barrido de la superficie de la membrana plasmática mostraron características de piroptosis, incluyendo formación de burbujas y ruptura de la membrana en células estimuladas con LPS/ATP, mientras que las células de control parecían normales. Además, la estimulación de LPS/ATP condujo a la aparición de características apoptóticas en las células, como la formación de ampollas y la contracción celular, y se observaron células con características de necroptosis que incluían hinchazón celular y ruptura de membrana.
