Después de recolectar haces de gametos hermafroditas y esperma de especies de coral gonocórico, colóquelos en tubos etiquetados de 50 mililitros. Coloque cuatro microlitros de suspensión de esperma activado en una cámara de recuento Makler. Para evaluar la motilidad de los espermatozoides, agregue la concentración de la muestra activada.
Abra el archivo de la hoja de datos automática del biobanco de corales e ingrese el factor de dilución de espermatozoides utilizado para la evaluación del análisis de esperma asistido por computadora. Luego, ingrese los resultados del análisis de esperma asistido por computadora para la concentración de espermatozoides, la motilidad total y la motilidad progresiva. Escriba la concentración de espermatozoides en el tubo de muestra de esperma filtrado y transfiera el tubo a la estación de trabajo de criopreservación.
Abra la hoja de datos automática del biobanco de corales compartidos y seleccione la pestaña Criopreservación. Después de comprobar la etiqueta del tubo de la muestra de semen, identifique la entrada correspondiente comprobando la identificación de la colonia. Con una pipeta serológica, mida el volumen de la muestra de esperma extrayéndola y expulsándola de nuevo en el mismo tubo. Introduzca el valor en la columna E.Compruebe la columna 1 calculada automáticamente para la concentración de crioprotector requerida y la columna H para el volumen de criodiluyente que se va a añadir.
Inicie un temporizador. Y con una pipeta, agregue gota a gota el criodiluyente DMSO con una mezcla suave y constante de la muestra. Registre la hora de la edición criodiluyente en la columna P.Lea la columna K para determinar el número de viales criogénicos a llenar.
Destape los viales criogénicos estériles con código de barras y coloque las tapas sobre una superficie estéril. Con una pipeta serológica y una pipeta alícuota, alícuota un mililitro de muestras en viales criogénicos con código de barras y retaponar viales. Coloque un vial de termopar y todos los viales de muestra llenos en un inserto de rejilla criogénica vacío a temperatura ambiente.
A continuación, coloque los viales criogénicos ficticios que contienen un 10% de DMSO en agua de mar filtrada en ranuras vacías en la rejilla criogénica. Introduzca el número de tirada en la columna U de la hoja de datos automática y escanee el número de serie del criómetro en la columna V. Coloque el cursor en la celda correcta de la columna Z y escanee el vial de termopar, seguido de todos los tubos del vial criogénico. Deje a un lado las gradillas cargadas y escaneadas para el resto del equilibrio del crioprotector.
Llene el recipiente de enfriamiento del bastidor criogénico con nitrógeno líquido hasta el nivel necesario para enfriar a aproximadamente 20 grados Celsius por minuto. Después del período de equilibrio crioprotector de 10 minutos, conecte la sonda de termopar al registrador de datos y comience a grabar. Coloque suavemente la rejilla criogénica llena en el recipiente de enfriamiento y aplique la tapa.
Registre la hora de inicio en la columna Q. Una vez que el vial del termopar indique 80 grados centígrados o menos en el registrador de datos, transfiera el inserto del bastidor criogénico a un baño de nitrógeno líquido para enfriar las muestras. Retire los viales criogénicos del estante y transfiéralos a un contenedor seco para transportarlos al biobanco. En Acropora millepora, los portaobjetos de la cámara de cubreobjetos fijos mostraron menos de la mitad de los recuentos de concentración de espermatozoides en comparación con la cámara de recuento de Makler.
La validación de la cámara de recuento Makler con microperlas de látex disponibles en el mercado a una concentración conocida dio como resultado recuentos consistentes con baja variabilidad dentro del rango esperado. No se observaron diferencias significativas en las concentraciones posteriores a la descongelación de espermatozoides totales, móviles o progresivamente móviles en las muestras criopreservadas utilizando DMSO al 20% o al 30% como criodiluyente.
