Para empezar, recupere dos tubos de criopreservación que contienen células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano congeladas en el pasaje tres del nitrógeno líquido. Agítalos en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que se descongelen por completo. A continuación, desinfecte los tubos con alcohol al 75%.
Coloque los tubos desinfectados sobre una mesa ultra limpia. Con una pipeta, aspire la suspensión celular y transfiérala a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar el tubo en una centrífuga de baja velocidad a 250 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Mientras tanto, prepare cuatro platos de cultivo de 10 centímetros y agregue nueve mililitros de medio a cada plato. Marque el nombre, el tipo de célula, la generación y la fecha del experimento en cada plato. Luego precaliéntelos en una incubadora de celdas termostáticas a 37 grados centígrados.
Una vez finalizados los cinco minutos de centrifugación, desinfecte el tubo de centrífuga antes de pasarlo a una mesa ultra limpia. Con ayuda de una pipeta, retire el sobrenadante y añada cuatro mililitros de medio para conseguir la concentración celular deseada. Agite suavemente la solución hasta que se disperse uniformemente.
A continuación, agregue un mililitro de suspensión celular a cada plato precalentado y agítelo agitando el mismo sobre una superficie nivelada en un patrón cruzado. Observe las células con un aumento de 40x bajo un microscopio óptico antes de colocar las placas en la incubadora de 37 grados Celsius. En el segundo día, observe el estado de la célula bajo el microscopio óptico con un aumento de 40x antes de proceder a la preparación del medio de intercambio.
Después de la desinfección, transfiera las placas de cultivo a una mesa ultralimpia con nivel de bioseguridad 2. Retire el medio de cada plato de cultivo. Enjuague el plato suavemente con dos mililitros de solución de PBS dos veces y agregue 10 mililitros de medio a cada plato.
Transfiera las células a la incubadora hasta que estén listas para la recolección del sobrenadante.
