Para comenzar, recoja el sobrenadante del cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano una vez que las células tengan un 80% de confluente. Recoja el sobrenadante con cuidado con una pipeta y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar las células en suspensión, luego use una pipeta para recolectar el sobrenadante sin alterar el pellet.
Centrifugar el sobrenadante a 2000 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Recoja el sobrenadante resultante con una pipeta y fíltrelo a través de una membrana de 0,22 micras para eliminar las partículas grandes y los restos celulares. Someter el filtrado a ultracentrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, realice una centrifugación final a 100.000 x g durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta, retire el sobrenadante sin recoger el pellet. Vuelva a suspender el pellet en PBS antes de centrifugar el tubo a 100.000 x g durante 70 minutos a cuatro grados centígrados.
Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet obtenido de vesículas extracelulares, o EVs, en un mililitro de PBS. Finalmente, transfiera la suspensión EV a un tubo de centrífuga de un mililitro y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta su posterior análisis. La microscopía electrónica de transmisión reveló claramente la estructura en forma de copa de los vehículos eléctricos con una membrana bicapa.
El análisis de seguimiento de nanopartículas indicó que tienen una distribución de tamaño de partícula de alrededor de 50 a 150 nanómetros. El análisis de Western blot mostró que las proteínas marcadoras características de las VE se expresaron sin problemas.
