Para empezar, coloca un colador de 70 micrómetros sobre un tubo de polipropileno de cinco mililitros. Pipetear 500 microlitros del medio de la célula neural sobre él. Transfiera el homogeneizado de tejido disociado del hipocampo de ratón al tubo a través del colador.
A continuación, pipetee un mililitro de medio de células neurales frías sobre el homogeneizador dos veces para enjuagarlo. Ahora, agregue 500 microlitros de DPBS helado al pellet para volver a suspenderlo. Compensar el volumen de la suspensión a 1,5 mililitros con DPBS.
Pipetear 500 microlitros de solución isotónica de percoll a la muestra. Superponga la solución con dos mililitros de DPBS frío en la centrífuga. A continuación, aspire la capa superior y el disco de mielina en la fase media.
A continuación, agregue cuatro mililitros de DPBS frío en el tubo, aspire el sobrenadante después de centrifugarlo. A continuación, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de solución de tinción de viabilidad fijable. Pipetear un mililitro de DPBS frío en la muestra antes de centrifugar la muestra a 300 x g durante cinco minutos.
Después de aspirar el sobrenadante, agregue 100 microlitros de solución de tinción CD16, CD32. Agite la muestra durante cinco segundos y luego incube. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón FACS a la muestra y centrifuga.
Pipetee 100 microlitros de la mezcla maestra de tinción en el tubo. A continuación, incubar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Ahora, agregue un mililitro de tampón FACS a la muestra antes de centrifugar como antes.
Vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón de fijación después de desechar el sobrenadante. A continuación, añada dos mililitros de tampón de permeabilización al tubo y vuelva a centrifugar. Pipetear 100 microlitros de solución de tinción vGLUT1 en el pellet.
A continuación, agite la mezcla durante unos cinco segundos antes de la incubación y la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet celular en 250 microlitros de tampón FACS. Finalmente, filtre las muestras a través de un filtro de 40 micrómetros.
Se observó una señal fluorescente vGLUT1-PE más alta de la microglía del hipocampo en comparación con el control del isotipo. Se encontró una señal fluorescente vGLUT1-PE más alta en la microglía del bulbo olfatorio y una señal más baja en el cerebelo en comparación con el hipocampo. La intensidad de señal más baja se detectó en los macrófagos del bazo.
