Para empezar, rocíe la piel del ratón con etanol al 70%. Luego, con unas tijeras de disección estériles, abra la piel y exponga el músculo de la pierna. Corta el músculo a lo largo de la pierna para ver el hueso con claridad y retira suavemente el hueso sin dañarlo.
Coloque inmediatamente el hueso en un tubo que contenga 4% de paraldehído y coloque el tubo en hielo. Después de recolectar todas las muestras de hueso, coloque los tubos a cuatro grados centígrados en una cámara frigorífica en un agitador orbital durante un mínimo de 24 horas. Después de la fijación, extraiga el tejido óseo del agitador orbital y lávese con 1X PBS dos veces durante tres minutos cada una.
Luego, use tijeras de disección estériles para eliminar cualquier músculo restante adherido al hueso. Vuelva a lavar el hueso con 1X PBS durante tres minutos. Coloque el hueso en un recipiente nuevo que contenga 20% de DDTA a pH ocho e incube en un agitador orbital a 140 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego, reemplace la solución de EDTA con 20% de DDTA fresco y repita la agitación durante otros 30 minutos. Después del tratamiento final con EDTA, agregue EDTA fresco e incube el recipiente a cuatro grados centígrados en un agitador orbital durante la noche. A continuación, recupere las muestras del contenedor de EDTA y lávelas dos veces con 1X PBS para eliminar los residuos de EDTA.
Inicie el proceso de deshidratación colocando el hueso en etanol al 70% e incubándolo durante 15 minutos a 140 RPM. Luego, deseche la solución de etanol al 70% y agregue la solución de etanol al 90%. Incubar durante 15 minutos a 140 RPM.
A continuación, inicie el proceso de limpieza colocando el tejido óseo deshidratado en un nuevo recipiente con xileno. Incubar durante 20 minutos a 140 RPM. Reemplace el xileno usado con xileno fresco e incube durante otros 20 minutos.
A continuación, coloque la muestra de hueso aclarada en un casete de inclusión y comience la infiltración de cera. Incubar durante 30 minutos a 60 grados centígrados. Deseche la cera usada, agregue cera nueva e incube durante otros 30 minutos.
Luego, reemplace la cera e incube por otros 45 minutos. Coloque con cuidado el hueso en un molde en la orientación deseada. Deja que la cera se solidifique sobre una superficie fría.
Guarde el bloque a cuatro grados centígrados hasta el momento de seccionarlo. A continuación, prepare el equipo para el seccionamiento. Rocíe todas las superficies de trabajo e instrumentos con soluciones descontaminantes para eliminar las RNasas.
Además, prepare un baño de agua con agua destilada doble a 42 grados centígrados. Limpie una cuchilla de micrótomo con etanol al 70% para eliminar el aceite, luego descontamine para eliminar las RNasas. Asegure la cuchilla en el micrótomo y asegúrese de que el ángulo de separación esté ajustado a 10 grados.
Rocíe pinzas, cepillos y sondas con soluciones descontaminantes y guárdelos en una cubeta de hielo. Prepare un baño de hielo agregando agua destilada doble a otra cubeta de hielo. Inicie el proceso de seccionamiento colocando el bloque FFPE en el micrótomo.
Establezca el micrótomo para recortar o establezca un grosor de desplazamiento de 14 micrómetros. Comience a recortar la muestra y continúe hasta que el tejido sea visible. Hidrata el bloque FFPE colocándolo en un baño de hielo.
Asegure la muestra hidratada en la pinza de muestras de micrótomo, alinéela con la cuchilla y ajuste el grosor del desplazamiento a cinco micrómetros. Comienza a seccionar el tejido. Recoja el pañuelo seccionado con pinzas frías y cepillos, y colóquelo en un baño de agua a 42 grados centígrados.
Coloque el tejido en un portaobjetos de vidrio e incube a 42 grados centígrados durante tres horas. Seque el portaobjetos durante la noche en un horno a temperatura ambiente. Guarde el portaobjetos preparado en una caja de portaobjetos a temperatura ambiente.
Con este método, se prepararon muestras óseas FFPE desmineralizadas a partir de fémures espejo. El curso del tiempo de descalcificación se optimizó comparando los fémures no calcificados con los descalcificados durante tres y 24 horas. La tinción H y E mostró que un tiempo de descalcificación más corto condujo a fracturas y daños en las secciones, mientras que el proceso de 24 horas resultó en una calidad histológica superior.
La evaluación de la calidad del ARN utilizando el valor de distribución de fragmentos de ARN DV200 reveló que las muestras descalcificadas mantuvieron puntuaciones DV200 superiores al 50% adecuadas para análisis como SCRNAC o transcriptómica espacial. Sin embargo, los tiempos de incubación prolongados resultaron en una disminución de la integridad del ARN y, por lo tanto, no se recomiendan.
