Para empezar, retira del congelador las células CD34+ que contienen la sangre criovial del cordón umbilical. Descongele las células en un baño de agua antes de transferirlas a un tubo de 50 mililitros. Mientras agita el tubo gota a gota, agregue 10 veces el volumen de las células de IMDM precalentado que contiene 50% de FBS y 0,1 miligramos por mililitro de DNasa al tubo.
Centrifugar la suspensión celular a 500 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 20 a 40 microlitros de PBS que contenga penicilina y estreptomicina. Guarde las celdas en hielo hasta su uso.
Prepare una jeringa de tres mililitros con una aguja de media pulgada de calibre 27. Prepare una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29 de 12,7 milímetros que contenga una suspensión de células CD34+ de la sangre del cordón umbilical. A continuación, prepare una jeringa de insulina de un mililitro con una aguja de 0,5 pulgadas de calibre 29 con 100 microlitros de buprenorfina.
Transfiera el ratón anestesiado a un cono de nariz y realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar que está listo para la inyección. Coloca al ratón boca arriba y flexiona sus patas traseras. Para asegurar las patas traseras, coloque el pulgar de la mano no dominante en el pie, el dedo medio en la cadera y el dedo índice en la parte exterior del fémur.
Arranca suavemente el vello alrededor de la rótula y limpia la zona con un hisopo con alcohol. Ahora, usando una jeringa de tres mililitros con una aguja de media pulgada de calibre 27, perfore suavemente un agujero a través de la piel hacia el fémur. Una vez que la aguja esté en el hueso, gírela en el sentido de las agujas del reloj hasta que toda la aguja esté en el hueso.
Retire la aguja girándola en sentido contrario a las agujas del reloj hasta la mitad del camino. Limpie alrededor de la aguja con un hisopo con alcohol y continúe girando la aguja en sentido contrario a las agujas del reloj para una extracción completa. A continuación, inserte la jeringa de insulina de 0,5 mililitros que contiene la suspensión celular en el eje femoral.
Una vez que la aguja esté en el hueso, suelte el agarre de la pierna e inyecte suavemente 25 microlitros de suspensión en el fémur. Finalmente, inyecte la buprenorfina por vía subcutánea y devuelva al ratón a su jaula de origen, lo que le permite recuperarse de la anestesia.
