Para empezar, siembre 20 millones de células de médula ósea de ratón neonato por matraz T75 en 10 mililitros de DMEM completo que contenga 2,5 mililitros de sobrenadante de células L929 al 10%. Incubar el matraz de cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cinco días. En el tercer día de diferenciación, agregue dos mililitros de medio acondicionado L929 en el matraz.
Bajo un microscopio invertido con un aumento de 20x, observe diariamente las células. Para recolectar los macrófagos en el quinto día, aspire el medio de diferenciación del matraz. Lavar las células con cinco mililitros de PBS para eliminar las células no adherentes y las proteínas séricas.
Añadir cinco mililitros de EDTA al 0,05% de tripsina al matraz e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Pasados cinco minutos, añadir cinco mililitros de DMEM y pipetear para separar las células. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante cinco minutos.
Disociar el paladar celular en un mililitro de DMEM completo. Cuente las celdas en un contador de celdas automatizado. En presencia del sobrenadante de células L929, las células de la médula ósea se diferenciaron en macrófagos en cinco días.
La formación de células fusiformes se observó a partir del segundo día, con casi la mitad mostrando esta morfología al tercer día y la mayoría al quinto día.
