Para comenzar, resuspender los macrófagos derivados de la médula ósea neonatal del ratón en DMEM completo sin rojo de fenol ni antibióticos. Siembre 500 microlitros de suspensión celular a una densidad de 200.000 por cuadrante en una placa cuádruple de 35 milímetros. Retire el stock precalculado de Escherichia coli de menos 80 grados Celsius.
Alícuota el volumen deseado de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para preparar el inóculo bacteriano a una multiplicidad de infección de 25, luego agregue PBS a un volumen total de un mililitro. Centrifugar la suspensión bacteriana a 2000 g durante cinco minutos y resuspender el pellet en 50 microlitros de PBS. Agregue un tinte verde fluorescente sensible al pH hasta una concentración final de 500 micromolares e incube durante 20 minutos en la oscuridad para la conjugación del tinte.
Lavar las bacterias cuatro veces con un mililitro de PBS por centrifugación a 1000 G durante cinco minutos. Resuspender el pellet en 500 microlitros de DMEM completo sin rojo fenol y añadir los cultivos de macrófagos derivados de la médula ósea. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.
Añadir 200 nanogramos de colorante fluorescente rojo permeable a las células para teñir los lisosomas, Tras la infección bacteriana, se detectaron abundantes bacterias fluorescentes verdes fagocitadas dentro de los macrófagos derivados de la médula ósea. La fluorescencia verde se localiza aún más con fluorescencia roja indicativa de lisosomas acidificados. También se observó la fagocitosis y la aparición de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal dipositivos sensibles al pH verde a lo largo de las cuatro horas de infección.
