Después de generar un cultivo celular MCF-7 inducido por peróxido de hidrógeno, deseche el sobrenadante de la placa de cultivo. Agregue un mililitro de PBS y agite suavemente el plato antes de desechar el PBS. Ahora agregue un mililitro de tripsina para lavar las células, agite el plato y espere un minuto, luego deseche la tripsina.
Golpee suavemente el plato, observe el movimiento de la célula en la hoja para confirmar el desprendimiento. A continuación, agregue cuatro mililitros de medio de cultivo completo y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión a 800 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante.
Agregue 200 microlitros de PBS para resuspender el pellet y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros. Después de eso, realice ciclos repetidos de congelación y descongelación para alterar las células. Centrifugar el lisado celular a 1500 g durante 10 minutos y recoger el sobrenadante para su análisis.
Descongele los reactivos de ELISA a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de comenzar el ensayo, precaliente el lector de ELISA 15 minutos antes de usarlo. Diluya el tampón de lavado 20 veces concentrado requerido con agua desionizada hasta obtener una solución de trabajo. Prepare soluciones de trabajo de muestras estándar y mézclelas cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo sin formación de burbujas.
Agregue 50 microlitros de solución de trabajo estándar y muestras de detección con diferentes concentraciones a los pocillos de reacción, excluyendo los pocillos en blanco, agregue 100 microlitros de anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante a cada pocillo de reacción. Selle los pocillos con un sello de placa e incube a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos.
Sacude el líquido restante en los pocillos y sécalo con papel absorbente. Agregue 350 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo de reacción. Después de uno o dos minutos, deseche el tampón antes de agregar 50 microlitros de sustratos A y B a cada pocillo de reacción.
Selle la placa e incube a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de 15 minutos, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pocillo de reacción. Mida inmediatamente el valor de densidad óptica a una longitud de onda de 450 nanómetros con un lector ELISA.
El efecto del peróxido de hidrógeno en la viabilidad de las células MCF-7 demostró que el tratamiento con 0,75 milimolar durante 12 horas redujo la viabilidad al 67%A una concentración más alta de 1,5 milimolar, la viabilidad celular se redujo drásticamente a menos del 3%Las células MCF-7 después de aumentar la concentración de tratamiento con peróxido de hidrógeno mostraron niveles aumentados de 8-Oxo-dG, lo que ilustra el impacto del estrés oxidativo en el daño del ADN.
