Para comenzar, adquiera las imágenes de las secciones de CHC inmunoteñidas. Descargue y abra QuPath 0.4.3. exe en la computadora.
Cree una nueva carpeta con un nombre adecuado para organizar proyectos de QuPath. Haga clic en el botón crear proyecto en la esquina superior izquierda del software y seleccione la carpeta recién creada. A continuación, arrastre las imágenes escaneadas a la ventana del software QuPath.
Una vez que aparezca una nueva ventana, seleccione establecer tipo de imagen y haga clic en H-DAB, seguido de importar. Para ver las imágenes importadas, consulte la lista en la ventana izquierda del menú y haga doble clic en una imagen para abrirla. Seleccione archivo en el menú principal y proceda a guardar las imágenes como un proyecto.
Elija las herramientas de pincel o varita en el menú principal para anotar el área del tumor. En los casos de regiones tumorales discontinuas, anote cada región por separado. Mantenga pulsada la tecla de control mientras selecciona todos los pasajes.
A continuación, haga clic con el botón derecho y elija editar varios y seleccione fusionar seleccionados. Luego, haga clic en automatizar en el menú principal y seleccione mostrar editor de scripts. Copie el script requerido, péguelo en el editor de scripts y, a continuación, haga clic en ejecutar.
Alternativamente, seleccione la herramienta de polilínea en el menú principal para dibujar con precisión un borde, separando los nidos de células malignas y el tejido no tumoral adyacente. A continuación, seleccione el borde en el menú principal, elija objetos, haga clic en anotación y seleccione expandir anotaciones. Establezca el radio de expansión en 500 micrómetros y elija plano para la tapa de línea.
Active, elimine el interior y asegúrese de que la restricción al padre esté activada. Ahora haga clic con el botón derecho en la anotación recién creada. Seleccione editar sencillo y elija dividir.
Para nombrar correctamente las regiones anotadas, haga clic con el botón derecho en la anotación en la lista de la izquierda. Seleccione establecer propiedades y escriba los nombres adecuados para las regiones de margen interior y exterior. Defina el área tumoral restante como el centro del tumor.
Se extienden un área peritumoral de 500 micrómetros de ancho adyacente al margen externo, como se demostró anteriormente. Para un análisis detallado de píxeles, seleccione la herramienta rectángulo en el menú principal. A continuación, anote una región que abarque todos los tipos de píxeles que se van a distinguir.
A continuación, navegue hasta el menú principal. Seleccione analizar y haga clic en preprocesamiento. A continuación, haga clic en estimar vector de mancha.
Al activar el editor visual de manchas, seleccione automático y haga clic en Aceptar. Asigne al vector de tinción estimado el nombre H-DAB. Para el análisis de píxeles, un método alternativo consiste en utilizar la herramienta de rectángulo del menú principal para resaltar una pequeña sección de un núcleo teñido con hematoxilina.
A continuación, accede al menú de la izquierda y selecciona imagen. A continuación, haga doble clic en la mancha uno y seleccione sí. De nuevo, utilice la herramienta de rectángulo para anotar una pequeña región, mostrando una tinción positiva con DAB.
Después de esto, seleccione la imagen en el menú de la izquierda y haga doble clic en la mancha dos, seguida de sí. Para evaluar la fracción de área de células inmunitarias positivas desde el menú principal, haga clic en la opción clasificar, seleccione clasificación de píxeles y haga clic en crear umbral. Después de eso, establezca la resolución en alta, seleccione el canal DAB y aplique un prefiltro gaussiano con un sigma de 0.5.
Ajuste el umbral entre 0,2 y 0,3. Defina los píxeles por encima del umbral como positivos y por debajo del umbral como negativos. Para la selección de región, opte por cualquier anotación.
Asigne un nombre al clasificador. A continuación, haga clic en guardar, medir y aceptar. Para documentar los hallazgos, copie los resultados que se muestran en el menú del lado izquierdo y transfiéralos a una hoja de cálculo.
Seleccione medir en el menú principal superior como método alternativo. A continuación, elija Mostrar medidas de anotación. Seleccione copiar en el portapapeles y pegue estos resultados en una hoja de cálculo para obtener un registro detallado.
Por último, haga clic con el botón derecho en la imagen, navegue hasta la vista múltiple y haga clic en cerrar visor para cerrar la imagen. La proteína CD117 se observó predominantemente en las membranas citoplasmáticas de las células redondeadas en el estroma tumoral y los espacios paravasculares. También se observaron células CD117 positivas en cápsulas tumorales y áreas paravasculares del margen externo y paratumorales.
La proteína NKp46 se observó principalmente en las membranas citoplasmáticas de las células redondeadas en espacios sinusoidales, el estroma del centro tumoral y el margen interno. Se observaron células positivas para Nkp46 en cápsulas alrededor de los nidos tumorales y el estroma de los tractos portales en el margen externo y las regiones peritumorales. La proteína CD1a se observó principalmente en las membranas citoplasmáticas de las células redondeadas, ya sea dispersas o en agregados en el estroma y espacios sinusoides en las regiones del centro tumoral y del margen interno.
Se encontraron células CD1a positivas en los sinusoides y el epitelio biliar de la región paratumoral.
