Para comenzar, prepare 30 microlitros de tampón de tinción a concentraciones de trabajo 2x para controles de un solo color y FMO. Transfiera el tampón de tinción de control FMO y de un solo color a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Rellene el volumen con 20 microlitros de tampón FACS.
Para teñir la muestra, prepare 0,5 mililitros de tampón de tinción FACS 2x en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Pipetea 10 microlitros de la celda de suspensión a un solo color y pocillos de control FMO. A continuación, añada 2 tampones de tinción FACS al resto de la suspensión celular e incube.
A continuación, agregue 100 microlitros de tampón FACS en los pocillos y dos mililitros del tampón en los tubos de muestra. Centrifugar a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspender el pellet celular en tampón de viabilidad.
Agregue 300 microlitros de medios de proliferación en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Estos actuarán como tubos de recolección para la clasificación de células. Después de clasificar las celdas con FACS, centrifugue las celdas recolectadas a 800 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.
Utilice una pipeta P1000 para eliminar con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Vuelva a suspender el pellet en un medio de proliferación hasta una densidad final de 100 células por microlitro. Siembre la suspensión celular en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos.
Finalmente, transfiera la placa a una incubadora a 37 grados centígrados bajo la suplementación de gas respectiva hasta que las células estén confluentes. Las células confluentes con morfología típica de fibroblastos se obtuvieron a los cinco días del cultivo.
