Comience por recubrir la matriz extracelular en insertos de cultivo celular para el cultivo de monocapa 2D derivado de organoides. Aplique 100 microlitros de recubrimiento de matriz extracelular a la cámara apical de cada inserto de cultivo celular preparado y vuelva a colocar la tapa. A continuación, incubar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora.
En el caso de las células organoides rectales, después de la incubación, sustituya el recubrimiento de la matriz extracelular por un medio de cultivo monocapa rectal e incube durante la noche. Después de la digestión enzimática de los organoides y la filtración a células individuales, centrifugar la suspensión celular a 200 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y luego desechar el sobrenadante. A continuación, prepare 200 microlitros de las suspensiones celulares por inserto de cultivo celular en un medio de cultivo monocapa.
Recupere la placa de cultivo celular de 24 pocillos que contiene insertos de cultivo celular recubiertos de matriz extracelular. Usando succión al vacío, vacíe cuidadosamente la cámara apical de cada inserto de cultivo celular para evitar interrumpir el recubrimiento. Aplique cuidadosamente 200 microlitros de la suspensión unicelular a la cámara apical de cada inserto de cultivo celular.
Agregue 500 microlitros del medio de cultivo monocapa adecuadamente suplementado a la cámara basolateral de cada pocillo. A continuación, incubar la placa en una incubadora humidificada para promover la adhesión y el crecimiento celular, formando una monocapa 2D confluente en el inserto de cultivo celular. Cambie los medios de cultivo en las cámaras apical y basolateral cada dos días, comenzando 48 horas después de la siembra celular.
Para la tinción inmunofluorescente de monocapa 2D derivada de organoides, corte cuidadosamente la membrana del inserto de cultivo celular con una cuchilla de bisturí y coloque el inserto de cultivo celular en un portaobjetos de vidrio. Agregue medios de montaje en un cubreobjetos y colóquelo en el portaobjetos de vidrio antes de observar las celdas. Un día después de sembrar organoides maduros disociados en un inserto de cultivo celular, pareció formarse una monocapa 2D.
La microscopía electrónica de barrido reveló microvellosidades bien desarrolladas y demarcación celular en la superficie apical de las monocapas 2D cinco días después de la siembra. La tinción inmunofluorescente de las monocapas 2D confirmó la presencia de borde apical en cepillo, uniones de adherencia basolateral y células caliciformes productoras de moco en monocapas 2D derivadas de organoides ileales y rectales.
