Para empezar, coloca al ratón hembra experimental en una plataforma de trabajo. Por vía intraperitoneal, administrar 7,5 unidades internacionales de gonadotropina sérica de yegua preñada alrededor de las 20:00 horas del primer día. Después de 48 horas, inyectar por vía intraperitoneal 7,5 unidades internacionales de gonadotropina coriónica humana.
Divida la tapa de un plato de cultivo celular en mitades superior e inferior. En la mitad superior, coloque de cuatro a seis gotas de cinco microlitros cada una de PVP para la colocación de espermatozoides. Agregue de 8 a 10 gotas de cinco microlitros cada una de medio M2 en la mitad inferior para el procedimiento ICSI.
Cubra las gotas medianas PVP y M2 con aproximadamente tres mililitros de aceite mineral. Después de aislar la cauda epididimaria del ratón macho sacrificado, séquela suavemente con una gasa esterilizada. Abra la cola epididimaria y apriétela suavemente, usando fórceps para liberar los espermatozoides, recogiéndolos en tubos de líquido tubárico humano preequilibrados.
Enjuague la cola epididimal en el medio de líquido tubárico humano precalentado. Coloque el tubo descubierto a 37 grados centígrados y la incubadora de dióxido de carbono al 5% para la capacitación de los espermatozoides. Al cuarto día después de inyectar gonadotropina coriónica humana, coloque al ratón hembra sacrificado bajo un microscopio de disección.
Con una aguja de calibre 25, abra la ampolla del oviducto para liberar numerosos complejos de ovocitos cúmulos. Después de la capacitación, sonicar 100 microlitros de esperma durante cinco segundos para separar las cabezas de las colas. Llene la aguja de micromanipulación con el líquido de trabajo, asegurándose de que la porción llena mida 0,5 centímetros dentro de la aguja.
Instale la aguja en el brazo derecho del micromanipulador y asegúrela apretando la tapa de sujeción. A continuación, instale una pipeta de sujeción de micromanipulación de punta plana en el brazo izquierdo del micromanipulador. Coloque la aguja de inyección y la pipeta de sujeción en el campo de visión del microscopio.
Bajo un microscopio de polarización, determine la posición del huso de metafase dentro del ovocito para asegurarse de que el aparato del huso no esté en el lado de la inyección. Al entrar en contacto la aguja de inyección con la zona pelúcida, active los pulsos piezoeléctricos con una intensidad de cinco y una frecuencia de uno, creando una perforación en la zona pelúcida y permitiendo el paso de la aguja de inyección. Usando pulsos piezoeléctricos de intensidad uno y frecuencia uno, crea un pequeño poro en la membrana plasmática, asegurando que la cabeza del espermatozoide se inyecte en el ooplasma.
Usando pinzas atraumáticas, exteriorice cuidadosamente los ovarios, los oviductos y el útero de la rata hembra pseudo-embarazada anestesiada. Haga una pequeña incisión en ángulo hacia arriba con la punta de una aguja de jeringa en la pared uterina por debajo de la unión uterotubárica, evitando los vasos sanguíneos. Inserte suavemente el oviducto de dos a tres milímetros a través del pequeño orificio.
Utilizando el método ICSI, se logró una tasa de fertilización del 89,57% en ratones, con el 87,38% de los cigotos avanzando a la etapa embrionaria de 2 células dentro de las 24 horas posteriores a ICSI. La tasa de natalidad de las crías vivas después de la transferencia embrionaria se observó en un 42,5%No hubo fluctuaciones significativas en los niveles aleatorios de glucosa en sangre entre los ratones nacidos de forma natural y los ratones ICSI. Sin embargo, los ratones machos ICSI exhibieron consistentemente niveles elevados de glucosa en sangre en ayunas, lo que sugiere una homeostasis de la glucosa alterada.
En las pruebas de tolerancia a la glucosa, se observaron diferencias significativas en los niveles de glucosa en sangre entre los ratones machos y los ratones control, mientras que no se observaron diferencias en los ratones hembra. En el seguimiento del peso corporal, tanto los ratones machos como las hembras de ICSI mostraron un fenotipo de sobrepeso en comparación con los controles.
