Para empezar, adquiera las imágenes confocales de las rodajas del hipocampo del ratón. Después de abrir el archivo de imagen en el software Neurolucida 360, haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de punto de movimiento/pivote ubicada en la barra de herramientas superior de la ventana del entorno 3D. A continuación, haga clic con el botón izquierdo en la dendrita deseada para establecer el nuevo punto de pivote.
Después de eso, haga clic con el botón izquierdo en el icono de restablecer orientación para restaurar la vista original. A continuación, vuelve a hacer clic en la herramienta de movimiento/punto de pivote para continuar trazando la dendrita. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña del árbol dentro de la ventana del entorno 3D.
Seleccione "Guía del usuario" para el modo de rastreo y los núcleos direccionales, como el método en las opciones de rastreo "Guía del usuario". Para iniciar el trazado de dendritas, haga clic con el botón izquierdo en la dendrita tan pronto como aparezca un núcleo circular. A continuación, mueva el cursor a lo largo del segmento dendrítico.
Para asegurar una población continua del grano, mueva suavemente el cursor hacia adelante y hacia atrás sobre la dendrita. A continuación, haga clic con el botón izquierdo para proteger los kernels que se hayan detectado. Si los kernels se apoderan de la población, haga clic con el botón izquierdo donde aparece un kernel más adelante a lo largo de la dendrita para colocarlo manualmente y haga clic con el botón derecho para detener el seguimiento.
Haga clic con el botón izquierdo y arrastre dentro de la ventana del entorno 3D para comprobar la precisión del trazado dendrítico en las tres dimensiones, cabeceo, guiñada y balanceo. Localice los puntos en los que el trazado de las dendritas se desvía de la ruta prevista. Para corregir cualquier imprecisión en el trazado de dendritas, navegue hasta la pestaña de edición ubicada dentro del menú del árbol.
Haga clic con el botón izquierdo en la dendrita de interés y luego haga clic en los puntos para realizar los ajustes necesarios. A continuación, mueva los puntos colocados incorrectamente de nuevo al segmento de dendrita, haciendo clic y arrastrando. Haga clic con el botón izquierdo en el punto superfluo para eliminarlo y, a continuación, haga clic en el botón Eliminar.
Si los puntos no cubren adecuadamente el segmento de dendrita, ajuste su tamaño haciendo clic con el botón izquierdo sobre ellos y modificando el grosor con el control deslizante. Después de eso, navegue a la pestaña del lomo dentro de la ventana del entorno 3D. Establezca la configuración de detección para el rango exterior, la altura mínima y el recuento mínimo de vóxeles.
Ajuste la sensibilidad del detector al 70% y luego haga clic con el botón izquierdo en Detectar todo "para identificar las espinas en todas las dendritas de acuerdo con el nivel de sensibilidad establecido. Para una selección específica de dendritas, tome la opción Haga clic en la imagen" para detectar todas en la rama más cercana y haga clic manualmente con el botón izquierdo en cada dendrita para aplicar diferentes sensibilidades del detector. Después de detectar espinas, haga clic y arrastre la dendrita en las tres direcciones para examinar la cobertura.
Si las espinas detectadas están subllenas, incremente la sensibilidad del detector entre un 5% y un 10% y haga clic en Detectar todo" nuevamente para reemplazarlas a un nivel de sensibilidad más alto. Si se detectan espinas sobrellenas, reduzca la sensibilidad del detector entre un 5% y un 10% y seleccione "Detectar todo" una vez más para actualizar la detección de espinas con una sensibilidad más baja. A continuación, haga clic con el botón izquierdo en "Mantener espinas existentes" en la pestaña de loma del entorno 3D.
Si la opción "Haga clic en la imagen para detectar todo en la rama más cercana" está activa, asegúrese de anular la selección. Para centrarse en una dendrita específica para un análisis más detallado de la columna vertebral, haga clic con el botón izquierdo en Mover punto de pivote "y luego haga clic en la dendrita deseada para establecer el punto de pivote. Una vez establecido el punto de pivote, anule la selección de Mover punto de pivote"Identifique una columna dendrítica que aparezca sin relleno.
Aumente la sensibilidad del detector entre un 10% y un 20% más allá de la configuración anterior y haga clic con el botón izquierdo directamente en el lomo. Si el lomo no se rellena, aparecerá el mensaje "No se puede detectar un lomo en la ubicación seleccionada". Aumente la sensibilidad del detector de forma incremental, potencialmente superando el 100% hasta que se detecte un lomo y se llene adecuadamente.
Para corregir un lomo poco relleno, vaya a la pestaña de edición y haga clic con el botón izquierdo del ratón sobre él. Elija Eliminar" y luego anule la selección de la pestaña de edición. Aumente la sensibilidad entre un 5% y un 10% y vuelva a hacer clic con el botón izquierdo en el lomo.
Para un lomo sobrecargado, vaya a la pestaña de edición y selecciónelo. Haga clic en Eliminar" y luego anule la selección de la pestaña de edición. Reduzca la sensibilidad entre un 5% y un 10% y haga clic con el botón izquierdo en el lomo.
Inspeccione la dendrita en busca de espinas que puedan pertenecer a dendritas vecinas, falsos positivos o segmentos dendríticos identificados incorrectamente como espinas. Utilice Eliminar" para eliminar estas imprecisiones. Luego, acceda a las espinas identificadas en la dendrita.
En los casos en los que varias espinas puedan aparecer fusionadas en un solo conglomerado, acceda a la pestaña de edición, seleccione la columna vertebral del conglomerado y haga clic en "Ocultar selección" para evaluar. Si se confirma, dentro de la pestaña de edición, elija "Mostrar selección" y luego divida para separar los lomos. Con todas las espinas identificadas visualmente y correctamente representadas, vaya a la pestaña de lomo y seleccione "Clasificar todo" para clasificarlas en delgadas, champiñones, rechonchos y filopodios.
Después de completar todas las detecciones y clasificaciones de la columna vertebral, en la barra de herramientas superior de la ventana del entorno 3D, seleccione Guardar y ver" en Neurolucida Explorer para guardar los datos recopilados de los trazados. Dentro de la ventana del Explorador, navegue a la pestaña de vista y haga clic con el botón izquierdo en "Seleccionar todo" para resaltar todas las dendritas y espinas. Luego, proceda a la pestaña analizar ubicada en la barra de herramientas superior.
Haga clic con el botón izquierdo en el menú desplegable de estructura y seleccione "Análisis de estructura de rama" para iniciar un análisis estructural detallado de los elementos resaltados. Para el análisis de la densidad de la columna vertebral y el volumen promedio de la columna, seleccione cada árbol y cada dendrita. Luego, haga clic en Espines"seguido de Detalles del espina"Haga clic en Aceptar"para ejecutar el análisis y los resultados se mostrarán en dos ventanas distintas.
