Para empezar, obtenga organoides gástricos humanos en crecimiento activo con diámetros entre 200 y 700 micrómetros. Descongele la alícuota de la matriz extracelular, o MEC, en hielo durante al menos 45 minutos. Y precalentar placas de cultivo celular a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
Después de retirar los medios de los pocillos de la placa de cultivo, pipetee PBS helado en cada gota de ECM. Y rasque el gel con la punta de pipeta P-1000. Recoja el PBS con los fragmentos de ECM que contienen organoides en un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 200 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de aspirar el sobrenadante, agregue 350 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% en cada tubo y mezcle suavemente. Incubar los tubos en un baño de agua, templado a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos.
Agregue 600 microlitros de DMEM helado, suplementado con penicilina y estreptomicina a cada tubo, y pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo 40 veces. Centrifugar el tubo como se ha demostrado y volver a suspender la paleta de celdas en ECM líquido helado. Para cada muestra, coloque 40 microlitros de ECM líquida que contenga fragmentos de organoides en una línea delgada y horizontal a lo largo del diámetro de un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros.
Después de 15 a 30 minutos de incubación, agregue con cuidado dos mililitros de medio de expansión de organoides a la placa a lo largo del borde de la placa sin alterar el gel polimerizado.
