Para comenzar, con una pipeta, localice cinco microlitros de cada extracto a dos centímetros de distancia en los puntos marcados en la línea inferior de la placa de cromatografía en capa fina, o TLC. Deje que las manchas se sequen en la placa TLC y repita hasta que se carguen aproximadamente cinco miligramos de cada extracto en la placa. Prepare una solución 1:2 de diclorometano y metanol en un tanque de revelado de TLC.
Coloque la placa TLC en el tanque de revelado y revele, hasta que el solvente llegue a la línea marcada a dos centímetros de la parte superior de la placa. Una vez desarrollado, retire la placa TLC del tanque. Inmediatamente, localice los controles positivos en los puntos sobre la línea de solvente.
Coloque la placa en una caja de placa TLC esterilizada con etanol antes de que se evapore todo el solvente. Raspe la estera micelial de las cinco placas de patógenos con una espátula de metal estéril. Luego, transfiéralo a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Después de agregar 25 mililitros de caldo de papa dextrosa modificado con agar, agregue perlas de vidrio estériles al tubo y haga un vórtice durante cinco minutos para romper la estera micelial. Después de ensamblar el rociador de cromatografía en la campana, conecte el tubo. Luego, conecte el medidor de flujo a la configuración.
Transfiera la suspensión micelial al rociador de cromatografía usando una jeringa estéril con una punta de aguja para asegurarse de que los trozos grandes de micelio no obstruyan el rociador. Coloque las placas TLC desarrolladas anteriormente sobre toallas de papel estériles en la campana de flujo laminar para reducir el contacto de las manos con la placa, mientras aplica la suspensión de medios. Conecte la muestra de patógeno al rociador ensamblado y aplique tres capas de la suspensión a la placa TLC, permitiendo que la placa se seque completamente entre aplicaciones.
A continuación, prepare la configuración de la incubación añadiendo 50 mililitros de agua estéril en una caja de plástico esterilizada. Coloque cuatro placas de Petri en él para que se asiente la placa TLC. Además, coloque hojas de celulosa dobladas esterilizadas o papel de filtro a cada lado de la caja para retener la humedad.
Coloque la placa de ensayo completa en cuatro placas de Petri vacías en la caja. Incube el ensayo durante tres días a una semana o hasta que crezca una capa uniforme de micelios en toda la placa, excepto alrededor de los controles positivos y la zona de inhibición. Luego, con una cuchara de metal, raspe la sílice de las zonas de inhibición y colóquela en tubos de microcentrífuga.
Agregue 500 microlitros de metanol a cada tubo y vórtice para extraer los metabolitos de la sílice. Centrifugar los tubos para granular la sílice y transferir el sobrenadante a viales de cromatografía líquida para su análisis. Las imágenes bajo luz ultravioleta mostraron la separación de metabolitos en la placa TLC.
Después de la incubación, el patógeno pareció crecer uniformemente en toda la placa, excepto en los controles positivos y las zonas de inhibición.
