Aislamiento y preparación de suspensión unicelular esplénica de ratones para el análisis de citometría de flujo

Para comenzar, coloque el ratón sacrificado en posición supina en el banco limpio. Corta a lo largo de la línea media del abdomen del ratón y separa las estructuras abdominales capa por capa. Con unas pinzas, abra suavemente el epiplón mayor y el estómago.

A continuación, extraiga suavemente el bazo con el ligamento gastrosplénico y sepárelo sin rodeos de los tejidos y ligamentos circundantes para obtener un bazo intacto. Coloque un filtro celular de 70 micras en una placa de cultivo estéril de 100 milímetros. Agregue el bazo al colador de células y tritúrelo con un émbolo de jeringa.

Agregue de cinco a ocho mililitros de líquido de lavado homogeneizado para empujar las células esplénicas a través del filtro hacia la placa de cultivo. Centrifugar el filtrado a 450 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con el diluyente de muestra suministrado con el kit de separación de linfocitos.

Después de contar las células en un hemocitómetro, ajuste la concentración de células a 2 X 10 a una potencia de ocho células por mililitro. En un tubo de centrífuga, tome la misma cantidad de solución de separación de linfocitos que la suspensión unicelular de tejido. Pipetear cuidadosamente la suspensión unicelular sobre la superficie de la solución de separación de linfocitos y centrifugar a 800 g durante 30 minutos a 25 grados centígrados.

Después de la centrifugación, observe las cuatro capas del tubo de arriba a abajo. Con una pipeta, extraiga con cuidado la capa anular de linfocitos de color blanco lechoso en otro tubo. Agregue 10 mililitros de solución limpiadora al tubo para mezclar las células.

Centrifugar la suspensión celular a 250 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio RPMI 1640 para el recuento de células.