Para comenzar, cargue cinco microlitros de solución de hoechst en una jeringa Hamilton estéril de vidrio de 10 microlitros, conectada a una aguja roma de calibre 34. Inserte esta aguja de jeringa en la cámara anterior a través del túnel corneal autosellante e inyecte la solución. Mantenga la aguja en su lugar durante dos o tres segundos, hasta que todo el líquido se aclare.
Saque la aguja lentamente para extraerla, evitando fugas. A continuación, enuclea ambos ojos. Para aislar las córneas, corte la esclerótica alrededor del nervio óptico y haga cuatro cortes adicionales desde el nervio óptico hacia la córnea.
Escurre el exceso de líquido con el papel de filtro Whatman. Extienda la esclerótica cortada y separe la retina de la esclerótica. Saque y deseche el cristalino y la retina.
A continuación, retira el iris. Corta y desecha la esclerótica alrededor de la córnea. Y levante la córnea con cuidado.
Colocando las córneas en un portaobjetos de vidrio, tiñirlas con rojo de alizarina al 0,5% para identificar las células endoteliales. Después de eliminar el exceso de mancha, lave la córnea tres veces y coloque un cubreobjetos sobre ella. Examinar las córneas bajo un microscopio óptico para obtener imágenes de la tinción de rojo alizarina de las células endoteliales.
Además, evalúe las córneas bajo un microscopio fluorescente para observar la tinción de Hoechst y compárela con la córnea no inyectada como control. El colorante de Hoechst, un marcador fluorescente permeable a las células de unión al ADN, se utilizó para evaluar la biodisponibilidad del fármaco mediante inyección intracameral. La captación de hoechst por las células endoteliales de la córnea se examinó 15 minutos después de la inyección mediante microscopía fluorescente.
La tinción con rojo de alizarina resaltó los bordes intercelulares de la capa endotelial. Además, la tinción positiva de Hoechst dentro de los núcleos de las células endoteliales de la córnea confirmó la administración exitosa del colorante a través de este método.
