Para comenzar, obtenga 250 miligramos de SAT por encima del músculo principal de las pectorales durante la implantación de CIED en una solución de almacenamiento de tejido de clasificación de células activada magnéticamente. Prepare un miligramo por mililitro de colagenasa/dispasa en 10 mililitros de solución salina fría de Hanks'Balanced. Bajo una cabina de flujo laminar, triture los tejidos en trozos de un milímetro cúbico en 500 microlitros de solución de colagenasa/dispasa.
Agregue 4,5 mililitros de la solución de colagenasa/dispasa a la mezcla y transfiera el tejido triturado a un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros. Lave la tapa de la placa de Petri con cinco mililitros de solución de colagenasa/dispasa y agréguela al tubo. Incubar el tubo durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un rotador de tubos ajustado a 20 revoluciones por minuto.
Para detener la digestión, vierta 10 mililitros de medio de crecimiento completo de células endoteliales en el tubo. Después de triturar la mezcla digerida con una cánula Venflon de calibre 14, cuélela a través de un tamiz celular de 70 micrómetros y enjuáguela con 10 mililitros de tampón PBS-BSA al 0,5%. Centrifugar el filtrado a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Para eliminar las células muertas, agregue 200 microlitros de perlas de eliminación de células muertas al pellet de células tomadas en un tubo de microcentrífuga e incube. A continuación, conecte una columna de separación de líquidos con un filtro de 30 micrómetros al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 mililitros debajo. Después de lavar la columna con tampón de unión de eliminación de celdas muertas, agregue la suspensión de cuentas de muestra.
Déjalo pasar bajo la gravedad y recoge el eluido. A continuación, centrifugar el eluido de células vivas recogidas y volver a suspender el pellet resultante en 400 microlitros de 0,5% PBS-BSA. Incubar las células suspendidas con 20 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de anti-CD31 a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Después de centrifugar, vuelva a suspender el pellet de celda en 500 microlitros de 0,5% PBS-BSA. Conecte una columna con un filtro de 30 micrómetros al imán separador y coloque un tubo de centrífuga de 15 mililitros debajo. Agregue la suspensión de microperlas celulares a la columna y déjela pasar bajo la gravedad.
Después de lavar la columna, colóquela en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mililitros y agregue un mililitro de 0.5%PBS-BSA a la columna. Empuje el émbolo de la columna para recoger la fracción CD31 positiva. Centrifugar la muestra como se demostró anteriormente y resuspender la pastilla celular en un mililitro de medio de crecimiento de células endoteliales microvasculares completas.
Dispense la suspensión en dos pocillos de una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina al 2%. Cultive las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro semanas hasta que las células se vuelvan casi 80% confluentes.
