Después de expandir los colonoides derivados de pacientes con enfermedad de Crohn en una placa de 48 pocillos, retire suavemente el medio del borde del pocillo sin dañar la cúpula del colonoide. Añadir 300 microlitros de reactivo de disociación enzimática suplementado con 10 micromolares ROC1 y dos inhibidores Y-27632 a cada pocillo. Con una punta de pipeta P1000, raspe la superficie del pocillo para romper la cúpula del colonoide y pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo.
Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 15 mililitros. Incubar los colonoides recolectados en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Centrifugar los colonoides a 400 x g durante tres minutos y retirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 1,2 mililitros en el tubo.
A continuación, coloque la punta de la pipeta P1000 en la suspensión, sosteniéndola justo por encima de la parte inferior del tubo y pipetee rápidamente la suspensión dentro y fuera de la punta para disociar los colonoides. Observe el tubo bajo el microscopio para asegurarse de que no queden colonoides completos. Y los fragmentos de colonoides tienen un tamaño aproximado de 30 a 40 micrómetros.
A continuación, agregue 10 mililitros de medios de lavado de organoides helados al tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 400 x g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de lavado de organoides helado.
Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y etiquételo como un tubo de fragmento de colonoide. Después de mezclar, transfiera 50 microlitros de la muestra a un tubo nuevo y etiquételo como un tubo de recuento de células. Centrifugar el tubo a 400 x g durante tres minutos.
Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 microlitros de reactivo de disociación enzimática, suplementado con 10 micromolares Y-27632. Incube el tubo de recuento de células individuales en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Con una pipeta P1000 ajustada a 400 microlitros, pipetee rápidamente la muestra.
A continuación, observe la muestra al microscopio para asegurarse de que se produzca una suspensión de una sola célula. Agregue un mililitro de medio de lavado de organoide al tubo de recuento de células individuales. A continuación, centrifugar la suspensión y eliminar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 50 microlitros de medios de lavado de organoides.
Agregue 50 microlitros de azul de tripán y cuente las células con un hemocitómetro. En base a esto, calcule la concentración de células en el tubo de fragmento colonoide. Centrifugar el volumen requerido en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
A continuación, retire el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en extracto de membrana basal, o BME. Ahora en una placa de microtitulación preincubada de 96 pocillos, pipetee 10 microlitros de la solución de BME colonoide por pocillo y mezcle cuidadosamente la solución con regularidad para evitar una siembra desigual.
Invierta la placa e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 20 minutos, superponga los domos con 200 microlitros de medios de proliferación de organoides precalentados y continúe la incubación durante tres días.
