Después de incubar colonoides derivados de pacientes con enfermedad de Crohn durante tres días, incline la placa y retire el medio del borde de los pocillos. Agregue 200 microlitros por pocillo de medio de tratamiento de citocinas que contenga 2.5 micromolares de colorante fluorescente para la muerte celular. Incubar los colonoides a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante el tiempo de tratamiento requerido.
Después de la incubación, transfiera la placa a la etapa de un microscopio digital de epifluorescencia invertida y confirme que los colonoides en condiciones de toxicidad máxima están completamente lisados. Usando el canal de transmisión, concéntrese en un colonoide con células SYTOX positivas. A continuación, cambie al canal GFP.
Ajusta la intensidad de la luz y el tiempo de exposición para maximizar la señal fluorescente y minimizar el fondo. Con la configuración de imagen optimizada, observe las condiciones de ausencia de tinte y toxicidad máxima para asegurarse de que las muestras no estén sobreexpuestas o subexpuestas. Adquiera imágenes de transmisión y GFP de colonoides utilizando un enfoque de muestreo aleatorio seleccionando campos de visión que siguen un patrón de cuadrícula fija que cubre la cúpula del colonoide.
Guarde imágenes en formato gráfico de red portátil y expórtelas. Arrastre y suelte los archivos del conjunto de datos de imagen en la barra de herramientas de ImageJ y haga clic secuencialmente en Imagen, Pilas e Imágenes en pila para combinar los archivos. A continuación, haga clic en Imagen seguido de Tipo y 8 bits para convertir la pila de imágenes en un archivo de 8 bits.
Haga clic en la herramienta Selecciones a mano alzada y seleccione manualmente la región de interés en la imagen de transmisión. A continuación, desplácese por la pila de imágenes hasta la imagen de canal GFP correspondiente. En la barra de herramientas, haga clic en Analizar y establecer mediciones.
En la ventana de diálogo Establecer mediciones, marque el valor medio de gris y deje las demás casillas sin marcar. Con la imagen GFP seleccionada, haga clic en Analizar y medir. Una vez analizado el conjunto de datos, copie todos los datos de la ventana de resultados y péguelos en una hoja de cálculo.
Calcule la media de los valores de gris medios técnicos replicados para cada condición. Reste la media de la afección no tratada de cada afección de tratamiento. A continuación, divida cada condición de tratamiento por la media resta de fondo de la condición de toxicidad máxima.
Para calcular la viabilidad celular después del tratamiento, reste los valores normalizados de uno. Usando la ecuación dada, calcule el coeficiente de interacción de perturbaciones. La transmisión de imágenes fluorescentes superpuestas de colonoides a las ocho horas indicó que solo los colonoides tratados con interferón gamma más TNF alfa fueron positivos para la señal fluorescente.
A las 24 horas, los colonoides tratados con interferón gamma más TNF alfa mostraron grandes regiones positivas para la señal fluorescente con una clara ruptura en la morfología del colonoide. Los niveles de muerte celular a las ocho horas fueron bajos para los colonoides de control con BSA, con un ligero aumento en las condiciones tratadas con TNF alfa. A las 24 horas, los colonoides tratados con interferón gamma más TNF alfa mostraron los niveles más altos de muerte celular.
Los valores del IPC indicaron un ligero sinergismo a las ocho horas y un sinergia sustancial a las 24 horas. Esto confirmó una interacción sinérgica dependiente del tiempo entre el interferón gamma y el TNF alfa.
