Detección de microdominios Ca²⁺ a nivel subcelular en células T murinas primarias mediante microscopía de fluorescencia

Para comenzar, coloque 10 microlitros de las pilas CD4+ cargadas en el portaobjetos preparado y déjelas conectar durante tres a cinco minutos. Agregue suavemente 80 microlitros de tampón de medición de calcio al portaobjetos. Seleccione la lente de inmersión en aceite 100X.

Aplique una pequeña gota de aceite de inmersión y coloque el portaobjetos en la platina del microscopio. A continuación, ajuste el enfoque en el modo de campo claro. Seleccione un campo de visión con hasta 10 celdas que no estén en contacto entre sí y adquiera una imagen.

A continuación, agregue 10 microlitros de perlas o estimulantes recubiertos de anticuerpos después de un minuto, y mida durante un total de tres minutos usando 40 fotogramas por segundo o la velocidad de fotogramas máxima posible. Utilice el control deslizante para determinar el tiempo de contacto entre una cuenta y una celda de interés. En el menú Opciones del lado derecho, seleccione el contacto del cordón: x, y, t.

Seleccione el punto en el lado izquierdo de la imagen donde la celda y la cuenta hacen contacto. Seleccione Elegir celda haciendo clic en un punto dentro. Haga clic en la celda estimulada por esta cuenta, preferiblemente en el centro.

Haga clic en AGREGAR contacto de cuenta. Una vez que se hayan definido todos los contactos de las cuentas, haga clic en el botón Continuar y continúe con los archivos adicionales Las células de tipo salvaje mostraron una rápida formación de microdominios de calcio en el primer segundo después de la estimulación, que se expandió por toda la célula durante los 15 segundos siguientes. Por el contrario, las células mutantes P2x4 y P2x7 mostraron una disminución de la formación de microdominios de calcio, mientras que las células mutantes P2x4 también presentaron un nivel basal más bajo antes de la estimulación.

Al igual que los linfocitos T murinos, se observaron microdominios de calcio en el sitio de contacto de las perlas en las células T CD4+ humanas.