Para empezar, añadir 200 microlitros de cloruro de sodio de 100 milimolares a un tubo que contenga trofozoítos transfectados de naegleria gruberi. Centrifugar el tubo a 600 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 100 microlitros de EDTA de 100 milimolares.
Coloque el tubo en un bloque de calor durante 15 minutos a 98 grados centígrados para lisar las células. Centrifugar el tubo a 4 grados centígrados durante 10 minutos a máxima velocidad para granular los residuos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
A continuación, añada 0,5 volúmenes de acetato de amonio, tres volúmenes de etanol absoluto y un microlitro de glucógeno al sobrenadante. Invierta el tubo varias veces para mezclar, antes de incubarlo a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos o toda la noche. Después de la incubación, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos a 16.000 g.
Retire el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue 200 microlitros de etanol al 70% para lavarlo antes de centrifugar. Vuelva a suspender el pellet seco en agua desionizada estéril para lograr una densidad de trofozoíto de 10.000 trofozoítos por microlitro. Después de la PCR con cebador específico para el ADN transfectado y la detección de los trofozoítos transformados, añadir dos microlitros de colorante de carga 6X a las muestras de CERE.
A continuación, cargue las muestras teñidas en un gel de agarosa al 0,8%. Después de electrofluorescer el gel durante 1,5 a 2 horas, incubarlo en un tinte de ADN diluido en 100 mililitros de agua desionizada. Transfiera el gel manchado a agua desionizada durante 20 minutos para detenerlo.
Visualiza el gel en un sistema de luz ultravioleta para documentar los resultados. El análisis de PCR mostró que se detectó pGRUB en trofozoítos transfectados a través de al menos siete pasajes. pGEM se perdió después del primer paso, lo que indica que el plásmido vacío no fue retenido por las amebas.
