Para empezar, se cultivan las MSC en una placa de seis pocillos con el medio MSC humano que contiene un 1% de penicilina y estreptomicina. A continuación, proceda a etiquetar las células ARPE19 Mito-RFP con trazas celulares violetas en la membrana citoplasmática. Para ello, añada 20 microlitros de dimetilsulfóxido a un vial de reactivo violeta de trazas celulares y mezcle bien inmediatamente antes de usar.
Cultive las células ARPE19 Mito-RFP hasta la densidad deseada de 80 a 90%Para preparar la solución de carga, diluya la solución madre violeta de trazas celulares en DPBS precalentado. A continuación, retire el medio de cultivo de las células y sustitúyalo por un mililitro de solución de carga. Incubar las células durante 10 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, retire la solución de carga. Después de lavar las celdas dos veces con DPBS, agregue dos mililitros de medio fresco y completo. A continuación, incubar las células durante al menos 10 minutos a 37 grados centígrados para permitir que la traza celular violeta se someta a hidrólisis de acetato.
A continuación, prepare una placa de 24 pocillos agregando 50 microlitros de DPBS en cada pocillo. Inserte el cubreobjetos en la placa y deje que se asiente durante un minuto. Retire el DPBS de los pocillos usando presión negativa para asegurarse de que la corredera de la tapa esté cerca del fondo del plato.
Una vez que la densidad celular alcance el 80 al 90%, retire el medio original y lave las celdas una vez con DPBS, agregue un mililitro de la mezcla de tripsina EDTA DPBS e incube durante tres a cuatro minutos a 37 grados centígrados. A continuación, golpee suavemente la placa de seis pocillos para separar las células adheridas. Agregue un mililitro de medio fresco y completo para terminar la digestión.
A continuación, vuelva a suspender suavemente todas las células con una pistola de pipetas y transfiera todas las células recogidas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Ahora centrifuga las células a 200 G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de medio fresco.
Coloque 10 microlitros de suspensión celular en un plato de conteo para la enumeración. Después de sembrar las células MSC y ARPE19 en la placa de 24 pocillos, observe las células bajo un microscopio. Agite el plato hasta que las células se distribuyan uniformemente.
Incubarlos en el cultivo durante 24 horas. Para el cocultivo indirecto, ver 10.000 células ARPE19 en 500 microlitros de medio por pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque el inserto en el pocillo donde se han sembrado las celdas.
Siembre 10.000 células madre mesenquimales en 100 microlitros de medio en la cámara celular superior por pocillo.
