Para comenzar, tome las células MSC-Mito-GFP y ARPE19-Mito-RFP cocultivadas y retire el medio de las placas de 24 pocillos. Lave todas las células una vez con 500 microlitros por pocillo de 4% de poliformaldehído. Añadir 500 microlitros de poliformaldehído fresco al 4% y fijar las muestras durante 20 minutos.
A continuación, retire el fijador y lave las muestras tres veces durante 10 minutos cada una con DPBS. Después de retirar el PBS, agregue 500 microlitros por pocillo de solución de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de bloqueo.
Para preparar la solución de tinción con faloidina, diluya la solución de almacenamiento 400x a 1x con PBS. Agregue 200 microlitros de solución de tinción de faloidina a cada pocillo e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, recupere la solución de tinción y lave las muestras durante 10 minutos con DPBS.
Después de quitar el PBS, saque el cubreobjetos con una aguja de jeringa y deje que se seque al aire. Aplique una pequeña cantidad de medio de montaje en el portaobjetos y voltee con cuidado el cubreobjetos del portaobjetos para asegurarse de que el medio cubra uniformemente toda la superficie. Sella los bordes con esmalte de uñas.
Se observaron nanotubos tunelizantes o estructuras de TNT, estableciendo conexiones intercelulares entre tipos de células similares y diferentes. La transferencia mitocondrial se observó en las células ARPE-19 que contenían fluorescencia de punto verde de las MSC y en las MSC que contenían fluorescencia de punto rojo de las células ARPE-19. Las imágenes de súper resolución confirmaron la formación de TNT y detallaron la transferencia mitocondrial a través de TNT.
La cuantificación mostró que las MSC eran significativamente más capaces de donar mitocondrias en comparación con las células ARPE-19.
