Para comenzar, obtenga el portaobjetos montado en la muestra después de envejecerlo. Para tratar previamente el portaobjetos, sumérjalo en serie en frascos de coplin que contengan soluciones adecuadas para el tiempo especificado. Digiera el tejido con 100 a 200 microlitros de tampón de digestión de proteinasa K e incube a temperatura ambiente durante un minuto.
Para detener la digestión, sumerja inmediatamente el portaobjetos en serie en soluciones de etanol durante dos minutos cada una. Aplique la mezcla de hibridación FISH al portaobjetos y cubra la muestra con un cubreobjetos. Coloque los portaobjetos en una placa caliente, como un sistema de hibridación Slide Moat a 75 grados centígrados durante dos a cinco minutos.
Luego, transfiera el portaobjetos a otra placa caliente configurada a 37 grados centígrados para hibridar durante la noche. A continuación, sumerja el portaobjetos en el tampón de lavado tibio y retire con cuidado el cubreobjetos. Lave y tiña el portaobjetos con los reactivos adecuados en la oscuridad.
Sumerja rápidamente el portaobjetos en agua desionizada durante no más de un segundo y colóquelo sobre una toalla de papel. Después del secado, monte la guía con medios de montaje anti-decoloración. Coloque el cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas antes de tomar imágenes.
Con una lente de aceite 60X, capture la señal fluorescente en varias pilas Z. Por último, realice una proyección 3D máxima para lograr la mejor resolución y aplique la deconvolución u otros algoritmos de limpieza de fondo. En las muestras de cáncer de mama triple negativo, la FISH nuclear muestra principalmente dos puntos distintos por núcleo, que representan sus dos señales ERBB2.
Por el contrario, las muestras HER2 positivas muestran abundantes señales de FISH, lo que indica diferentes patrones de amplificación génica. Además, algunos núcleos en muestras HER2 positivas pueden exhibir grupos, lo que sugiere centros de ADN cromosómicos adicionales, que son puntos focales para una mayor amplificación de genes.
