Para empezar, obtenga microglía humana a partir de las células madre embrionarias humanas y recoséchelas en el día 56. Para la derivación de organoides retinianos, cultive las células madre embrionarias humanas en un medio de células madre hasta que la densidad celular alcance el 80 al 90%Agregue un mililitro de dispasa por pocillo a las células de cultivo e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Después de eliminar la dispasa, agregue un mililitro de D medio a cada pocillo.
Corta las células en trozos pequeños. Con una pipeta de 10 microlitros, recoja suavemente todas las piezas celulares y el medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 x g durante cinco minutos.
Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente las células en 200 microlitros de una matriz fría. Mueva el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a una incubadora durante 20 minutos. Después de 20 minutos en la incubadora, la matriz se solidificará.
Prepara un plato de 10 centímetros con 15 mililitros de medio D. Resuspender la matriz con medio D y agitar suavemente la placa de Petri. Coloque el plato en una incubadora durante cinco días. El día 12, reemplace el medio con tres mililitros de dispasa.
Pasados cinco minutos, aspirar la dispasa y añadir 15 mililitros de medio E.Introducir la microglía recolectada en los organoides retinianos digeridos el día 12. El día 19, agite suavemente la placa para agregar los organoides al centro de la placa y reemplace el medio E con un medio F. Finalmente, transfiera los organoides con medio F a un nuevo plato de suspensión. A los 30 días, los organoides de la retina cocultivados con microglía mostraron una autofluorescencia GFP significativa, lo que indica la presencia de microglía.
Los organoides retinianos cocultivados mostraron señales claras de inmunofluorescencia para el marcador fotorreceptor CRX y el marcador microglial IBA1.
