Para comenzar, inserte la cola del ratón en la abertura superior del tubo de sujeción. Tire lentamente del mouse dentro del tubo y coloque el enchufe delante del mouse para evitar que se escape. Para hacer una funda de restricción para un ratón más pequeño, corte en el extremo de la nariz del cono para asegurarse de que la nariz del ratón no esté obstruida y tenga suficiente espacio para respirar.
A continuación, corta la parte posterior del cono de forma similar a la longitud del ratón. Coloque el ratón en el sujetador de tubos como se ha descrito anteriormente. Mientras sostienes la cola del ratón, deja que el ratón camine hacia el cono.
Deslice el cono de restricción en el tubo. Asegúrate de que la cola del ratón esté completamente fuera de la parte posterior del tubo y que el ratón tenga espacio para respirar dentro del cono. Asegure el tapón del tubo inmediatamente delante de la abertura de la nariz del cono.
Llene el tubo cónico de 15 mililitros con agua tibia. Coloque el sujetador de tubo con el ratón dentro de él en la plataforma elevada. Sumerge la cola del ratón en agua tibia durante al menos un minuto hasta que las venas laterales estén claramente dilatadas y visibles.
Coloque el virus adenoasociado sin tapón, o AAV, que contiene un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros en la rejilla de tubos. Con la mano dominante, inserte la aguja verticalmente en el tubo. Una vez que la aguja esté dentro del tubo, sostenga el tubo con la mano no dominante.
A continuación, levante el tubo y la jeringa simultáneamente a la altura de los ojos, asegurándose de que la aguja no toque la pared del tubo. Apoye ambos brazos sobre la mesa y introduzca lentamente la dosis en la jeringa. Expulse las burbujas de aire de la jeringa sobre una almohadilla absorbente desechable.
Sostenga el inyector durante 40 segundos para calentarlo. Después de asegurarse de que las venas de la cola sean claramente visibles, retire el sujetador de tubo de la plataforma elevada y colóquelo directamente sobre la mesa. Coloque el ratón en el sujetador con las patas hacia abajo para facilitar el manejo de la cola.
Limpie rápidamente la cola con una gasa para secarla. Luego limpie la cola con un hisopo con alcohol y nuevamente séquela con una gasa seca. Gira la cola aproximadamente 90 grados hacia la izquierda o hacia la derecha para que una de las dos venas laterales quede hacia arriba.
Ubique un sitio de inyección adecuado dentro del tercio medio de la cola. Sujete la cola con la mano no dominante con el pulgar y el índice inmediatamente distal al lugar de la inyección. Doble la cola sobre el dedo índice para que el sitio de la inyección quede plano sobre el dedo índice.
A continuación, tire de la cola hacia atrás para estirarla y el lugar de la inyección quedará completamente horizontal. Sostenga la jeringa con los dedos índice y medio de la mano dominante a cada lado del reborde del cilindro de la jeringa mientras mantiene el pulgar listo en el émbolo. Apoye ambas manos sobre la mesa y coloque la aguja directamente sobre y paralela a la cola y la vena con el bisel hacia arriba.
Ahora aplique presión hacia abajo sobre la aguja y deslícela hacia adelante en la vena para inyectar la solución de AAV en la vena. Después de administrar la dosis, retire lentamente la aguja e inmediatamente aplique presión con gasa en el lugar de la inyección durante al menos 10 segundos hasta que se detenga el sangrado. Las imágenes histológicas de la proteína reportera fluorescente después de la inyección mostraron que tdTomato se expresaba de forma difusa en todo el hígado y los cuádriceps, lo que indica que AAV9 alcanzó y transdució ampliamente diferentes regiones de ambos tejidos.
