Para empezar, realice la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, para amplificar la región deseada del ADN extraído del tejido. Lleve la mezcla maestra de enzimas de amplificación de secuenciación, el tampón y el agua bidestilada a temperatura ambiente y centrifuga al instante. Después de preparar los tubos para la secuenciación, coloque el tubo de PCR en el instrumento de PCR preestablecido para la amplificación.
A continuación, retire el producto del instrumento de PCR y almacene los productos de reacción en el frigorífico, protegidos de la luz. Vórtice las cuentas magnéticas a fondo. Agregue 10 microlitros de perlas magnéticas y 40 microlitros de etanol al 80% a la placa de 96 pocillos y selle la placa con una película.
Coloque la placa de 96 pocillos en un agitador de vórtice durante 10 segundos para suspender y mezclar completamente las cuentas. A continuación, asegure la placa con una banda elástica en un oscilador horizontal y vibre al máximo durante tres a cinco minutos. A continuación, coloque la placa de PCR en un soporte magnético, asegurándose de que esté firmemente presionada.
Mantenga el soporte a cuatro grados centígrados durante tres minutos para la adsorción estática. Una vez que las perlas se hayan adsorbido, retire la película del techo y vierta el líquido residual. Enjuague las perlas dos veces con 40 microlitros de etanol al 80%.
Después de verter el líquido residual, coloque el plato sobre papel absorbente y séquelo suavemente. Coloque el papel absorbente con la placa magnética en una centrífuga y gire a 120 g brevemente. Después de quitar el alcohol, coloque la placa en un horno a 60 grados centígrados durante tres a cinco minutos para secar las cuentas por completo.
A continuación, añade 40 microlitros de agua pura al plato y séllalo con una película. Agítelo en un agitador de vórtice durante tres a cinco segundos y coloque el plato en un agitador horizontal. Asegúrelo y deje que la placa se agite durante tres a cinco minutos para disolver el producto de secuenciación purificado.
Por último, centrifugar el producto de secuenciación disuelto a 180 g y utilizar el producto para el análisis genómico mediante electroforesis capilar. Este método podría detectar la conocida mutación RHOA G17V y otras mutaciones de baja frecuencia en el intervalo de amplificación de los cebadores aguas arriba y aguas abajo. Las mutaciones en dos genes adicionales, a saber, IDH2 y JAK1, también se analizaron correctamente utilizando este método.
