Realice la obtención de imágenes de una sola molécula en una configuración comercial, combinando pinzas ópticas de doble haz con microscopía confocal. Utilice el canal de inyección uno para atrapar perlas, el canal dos para la unión de complejos de proteínas de ADN, el canal tres para verificar la presencia de CMG y los canales cuatro y cinco como reservorios de proteínas y ubicaciones de intercambio de tampones. Haga fluir todas las soluciones en la celda de flujo a una presión constante de 0,5 bar en el puerto de inyección.
A continuación, corte el flujo en los canales cuatro y cinco. Después de hacer fluir inicialmente todas las soluciones, reduzca la presión a 0,2 bar. Mueva los láseres de captura para canalizar uno hasta que una cuenta quede atrapada en cada trampa óptica.
Mueva las cuentas atrapadas al canal dos moviendo el joystick mientras presiona el gatillo. Usando el joystick sin presionar el gatillo, se pesca un complejo CMG de ADN moviendo la cuenta derecha hacia y lejos de la cuenta izquierda hasta que se atrapa una correa de ADN. Mueva las cuentas al canal tres e inmediatamente detenga el flujo en todos los canales.
Ajuste la potencia del láser de 561 nanómetros a cuatro microvatios en el panel láser de excitación y luego realice una prueba de escaneo de un cuadro del ADN en el canal tres. Si está presente, CMG aparecerá como puntos limitados de difracción bidimensional. En este caso, mueva la correa de ADN al canal cuatro o cinco para obtener imágenes.
De lo contrario, vuelva a abrir el flujo, deseche las cuentas y repita los pasos. En los canales cuatro o cinco, introduzca dos piconewtons en el panel de espectroscopia de fuerza y haga clic en el botón de activación para iniciar una pinza de fuerza. Una vez que la tensión inicial alcance los dos piconewtons, desactive la pinza de fuerza antes de obtener imágenes haciendo clic nuevamente en el botón de activación en el panel de espectroscopia de fuerza.
Haga clic en el botón Iniciar escaneo en el panel de escaneo de imagen. Visualice CMG fluorescente cada cinco segundos con un láser de 561 nanómetros a una potencia de cuatro microvatios medida en el objetivo. En una reacción libre de agregación, CMG apareció como puntos discretos, simétricos y limitados por difracción que abarrotaban escasamente el ADN.
Por el contrario, los agregados son menos discretos, a veces manchas asimétricas que se apiñan en una longitud mayor del ADN. Si el ensayo se ejecutó con éxito y se logró una alta pureza de las proteínas purificadas, se pudo observar un movimiento de largo alcance de CMG en presencia de ATP.
