Para empezar, descongela las células epiteliales de la superficie ovárica humana criopreservadas. Mezclar las celdas con 10 mililitros de medio de lavado. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de epitelio de superficie ovárica o medio OSE 2D y transfiéralo a dos pocillos de una placa de 12 pocillos.
Agregue un mililitro de medio OSE 2D adicional en el pocillo y cultive a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante 72 horas antes de la primera renovación del medio. Emplee la tinción con azul de tripán para contar células epiteliales de la superficie ovárica humana vivas recién aisladas o criopreservadas descongeladas con un contador de células automatizado. Mezcle el número deseado de células en un mililitro de medio básico de organoide OSE helado y centrifugue el tubo a 240 g durante cinco minutos.
Con una pipeta, vuelva a suspender el pellet de celda en una solución de extracto de membrana basal sin diluir helada para obtener 10.000 células por cada 10 microlitros. Agregue 10 gotas de microlitros de solución de extracto de membrana basal OSE por pocillo en un portaobjetos precalentado con cámara múltiple y coloque la placa boca abajo a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Después de que el gel se solidifique, agregue 100 microlitros de medio OSE 3D y cultive a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Después de eliminar el medio gastado, agregue 100 microlitros de DMEM F12 avanzado helado a cada pocillo. Raspe el fondo de los pocillos con una punta de pipeta P1000 para separar las gotas de gel y transferir cada gota de gel flotante a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 240 g durante cinco minutos.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de tampón de disociación celular y coloque los tubos en un baño de perlas precalentado a 37 grados centígrados durante 5 a 10 minutos. A continuación, agregue 300 microlitros de medio básico de organoide OSE humano y centrifugue a 240 G durante cinco minutos. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en el volumen deseado de solución de extracto de membrana basal sin diluir para resembrarlos en una proporción adecuada para el cultivo.
Las células OSE humanas primarias exhibieron una morfología similar a un adoquín hasta el pasaje tres, pero mostraron signos de senescencia a partir de entonces. Los organoides OSE humanos de células OSE recién aisladas crecieron más que los de las células OSE expandidas en 2D después de 14 días en cultivo. Se observaron varias morfologías en los organoides OSE 3D, incluidos grupos de células quísticas, monocapa, multicapa y no lumenizadas.
