Para comenzar, cultive el tejido cerebeloso picado recuperado de una cría de ratón de 10 días de edad en un águila mediana basal. Agregue productos químicos que dañan el ADN directamente al medio de cultivo en concentraciones finales apropiadas. Después del período de exposición, reemplace el medio con un medio mezclado recién preparado que contenga los productos químicos que dañan el ADN y el inhibidor de la poli ADP ribosa glicohidrolasa, e incube durante 30 minutos.
Después de 30 minutos, lavar las rodajas con tampón de fosfato 0,1 molar a temperatura ambiente y fijarlas inmediatamente con una mezcla de acetona y metanol preenfriada. Incubar la placa durante 20 minutos a menos 20 grados centígrados. A continuación, retire la solución de fijación y lávela con tampón de fosfato 0,4 molar.
Agregue 100 microlitros de tampón de fosfato 0.1 molar a cada pocillo de una placa de 48 pocillos. A continuación, utiliza un bisturí y una tabla de cortar para quitar los márgenes del inserto, cortando alrededor de la rodaja de tejido. Coloque la rebanada en un pocillo de la placa de 48 pocillos.
Después de aspirar el tampón, incubar el inserto con 100 microlitros de tampón de fosfato 0,1 molar que contenga 1%Triton X100. Aspire la solución e incube en serie el inserto en cada pocillo en un agitador con cantidades adecuadas de solución bloqueante seguida de los anticuerpos primarios en los secundarios. Agregue 20 microlitros de la solución final de DAPI a cada pocillo 20 minutos antes del final de la incubación de dos horas con el anticuerpo secundario y continúe agitando durante 20 minutos.
Para el montaje, coloque el tejido en un portaobjetos de vidrio de microscopio con el tejido hacia arriba. Agregue el medio de montaje y cúbralo con un cubreobjetos. Coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y déjelos secar durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados.
La foliación cerebelosa se mantuvo en el cultivo. Las células de Purkinje se tiñeron para Calbindin D-28K y los núcleos neurales se tiñeron para NeuN. Los astrocitos de las células de Purkinje se tiñeron para GFAP.
La tinción de PAR aumentó en las células de Purkinje tratadas después de la exposición al bromato de potasio y al paraquat, lo que indica daño en el ADN.
