Para empezar, añada 500 microlitros de tampón de imagen sin proteínas al canal 3 de la celda de flujo. Mezcle dos nanomolares de Saccharomyces cerevisiae NAP1 y dos a cinco nanomolares de octámero de histonas H4 marcadas con LD655 con 500 microlitros de tampón 1X HR. Agregue esta mezcla al canal 4 de la celda de flujo.
Fluya todos los canales a 1,0 bar durante 30 segundos para enjuagarlos con muestras. Ajuste el flujo a 0,2 bar y mueva las trampas ópticas al canal 1 para atrapar un par adecuado de perlas recubiertas de estreptavidina. A continuación, mueva las trampas ópticas al canal 3.
Apague el flujo y realice una calibración forzada para el par de cuentas. Encienda el láser confocal rojo y calibre el área de imagen. Después de ajustar el flujo a 0,2 bar, mueva las trampas ópticas al canal 2 para atrapar el ADN biotinilado.
A continuación, mueva las trampas ópticas al canal 3 y detenga el flujo. Aumente la distancia entre las trampas ópticas para estirar el ADN y monitoree la curva de distancia forzada asociada para confirmar la presencia de una sola atadura de ADN. Ajuste la distancia entre las trampas ópticas para que la tensión del ADN sea de aproximadamente un piconewton.
Encienda el escaneo de líneas para comenzar a recopilar un quimógrafo con el láser rojo encendido. A continuación, mueva las trampas ópticas al canal 4 con el flujo apagado para formar nucleosomas a lo largo de la atadura del ADN. Para desenvolver nucleosomas, mueva las trampas ópticas al canal 3.
Estableciendo la lectura de fuerza en 0 y la velocidad en 0,1 micrómetros por segundo, aleje la trampa óptica 1 de la trampa óptica 2. Mezcle 10 nanomolares de histona enlazadora H1.4 marcada con Cy3 con 500 microlitros de tampón de imagen y agregue al canal 5. Después de formar una correa de ADN que contenga nucleosomas, encienda el láser verde, además del láser rojo, y mueva las trampas ópticas al canal 5 para obtener imágenes en tiempo real de la unión de H1 a la cromatina.
La formación de nucleosomas a lo largo de la correa de ADN se visualizó como focos fluorescentes rojos estacionarios en un escaneo 2D y un quimógrafo. El análisis de fotoblanqueo mostró eventos de fotoblanqueo de uno o dos pasos, lo que indica la presencia de mononucleosomas. En ausencia de NAP1, los octámeros de histonas se unieron al ADN, pero permanecieron en su mayoría sin envolver, lo que se indica por la tensión constante.
Usando H2A marcado con Cy3, se obtuvieron resultados de ensamblaje de nucleosomas similares, al igual que con H4 marcado con LD655. El desenvolvimiento de nucleosomas aumentó la distancia de amarre con el tiempo, visible en el cimograma, y generó curvas de distancia forzada con desgarros característicos que denotan el desenvolvimiento de nucleosomas individuales. La unión de la histona enlazadora H1 a la cromatina se indicó mediante focos fluorescentes verdes con trayectorias estacionarias de doble color que representan la unión de H1 a los nucleosomas, y trayectorias irregulares verdes que representan trayectorias H1 difusoras.
