Comience preparando una reserva de infección por Pseudomonas aeruginosa de unidades formadoras de colonias conocidas por mililitro antes de la infección. Para peletizar el caldo infeccioso, centrifugar a 10.000 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en PBS.
A continuación, prepare tres tubos de microfuga de un mililitro que contengan agua destilada estéril, etanol o PBS estéril. Inspeccione una jeringa Hamilton estéril de 100 microlitros, asegurándose de que la punta de la aguja esté afilada y no haya desarrollado un gancho que pueda causar un traumatismo significativo en el sitio de la infección. Ahora lave la jeringa secuencialmente con agua destilada, etanol y PBS antes de las infecciones, extrayendo y desechando la capacidad máxima.
A continuación, agite el inóculo de infección resuspendido y extraiga un máximo de 100 microlitros en la jeringa Hamilton, suficiente para inyectar 10 microlitros por larva. Posteriormente, inyecte cada larva de Galleria mellonella con 10 microlitros de inóculo en la propata trasera derecha. Incubar las larvas infectadas entre 20 grados Celsius y 42 grados Celsius, que es un rango apropiado para la supervivencia de Galleria mellonella.
Preparar una amplia gama de dosis que superen el rango terapéutico esperado del agente antimicrobiano guiado por datos de toxicidad in vitro. Inyecte Galleria mellonella sana y estéril en grupos apropiados con las diferentes concentraciones de antimicrobianos y PBS del vehículo. Para optimizar el tratamiento de la infección bacteriana en Galleria mellonella, prepare una gama adecuada de dosis de agentes antimicrobianos sobre la base de pruebas preliminares de toxicidad.
Infecte grupos de larvas con bacterias como se describió anteriormente a las dos horas posteriores a la infección. Trate las larvas con el agente antimicrobiano preparado o la solución de control del vehículo. Monitorizar la supervivencia de Galleria mellonella a intervalos de 30 minutos o con mayor frecuencia desde el momento en que se suele observar la mortalidad por primera vez.
Retire las larvas muertas y registre su hora de muerte. Para comparar cómo el momento del tratamiento afecta la mortalidad, trate las larvas a las 2, 4, 6, 9 o 12 horas después de la infección y controle su supervivencia en un intervalo de 30 minutos. La dosis efectiva de tobramicina varió según la cepa.
Cinco miligramos por kilogramo fue óptimo para la PAO1 y la PA14,2,5 miligramos por kilogramo para la PAK y 10 miligramos por kilogramo para el mucoide IST27. Ninguna dosis fue efectiva para el LESB58. El tratamiento con cinco miligramos por kilogramo de tobramicina a las dos, cuatro y seis horas después de la infección resultó en una supervivencia de más del 50% de las larvas de Galleria mellonella infectadas con Plasmodium aeruginosa.
