Para empezar, genere ensamblajes marcados con virus utilizando organoides cerebrales específicos del destino. Para preparar los reactivos para el pretratamiento de superficies MEA, disuelva 0,5 gramos de polvo de enzima detergente en 50 mililitros de agua desionizada. Agite la mezcla a fondo hasta que el polvo se disuelva por completo y esterilice la solución utilizando un filtro de vacío superior de tubo estéril dentro de la cabina de bioseguridad.
Diluya 500 microlitros de la solución madre de polietilemina al 7% o PEI con 49,5 mililitros de tampón de borato 1X para preparar una solución de PEI al 0,07%. Para esterilizar la solución, fíltrela a través de una unidad de filtro de 0,22 micrómetros dentro del gabinete de bioseguridad. A continuación, dispense un mililitro de la solución de enzima detergente al 1% en cada pocillo de una placa MEA estéril e incube a 37 grados centígrados durante dos horas.
A continuación, retire la solución de enzimas detergentes de cada pocillo y lave los pocillos cinco veces con 1,5 mililitros de agua desionizada estéril por pocillo. Llene cada pocillo con un mililitro de medio de cultivo para el preacondicionamiento. Vuelva a colocar las placas de MEA en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante dos días.
Después de la incubación, retire los medios de cultivo de los pocillos y agregue 50 microlitros de solución de PEI al 0,07% para cubrir los electrodos de MEA para el recubrimiento primario. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, aspire la solución de PEI completamente de cada pocillo.
Lave cada pocillo tres veces con un mililitro de agua desionizada estéril. Después de aspirar el agua, seque las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos en la cabina de bioseguridad con la tapa abierta. Ahora cubra el área del electrodo en cada pocillo con 50 microlitros de una matriz de membrana basal de uno a 20 volumen a volumen diluida en medios de cultivo para el recubrimiento secundario.
Vuelva a colocar las placas de MEA en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, aspire la solución de matriz diluida, dejando una capa delgada en la superficie. Si se forma una capa gruesa, rocíe enérgicamente el área de contacto del electrodo con medios de cultivo con una punta de pipeta P1000.
Luego, usando una punta P1000 con un corte ancho, recoja un ensamblaje del plato y colóquelo con cuidado encima de los electrodos en un pocillo mientras transfiere la menor cantidad de medios posible. Coloque la placa bajo un microscopio de disección en una campana de flujo laminar y, con una punta P 20 estéril, empuje con cuidado el conjunto hasta la ubicación deseada. Utilice una punta P 20 para eliminar el exceso de líquido alrededor del conjunto.
Después de la incubación, retire la placa de la incubadora. Luego, observando bajo un microscopio de disección, aplique dos o tres gotas pequeñas de una a 50 matrices de membrana basal diluidas en medios de cultivo sobre los ensamblajes, y devuelva la placa a la incubadora durante otros 30 minutos. A continuación, añada con cuidado tres gotas de medio de cultivo cerca de los conjuntos utilizando un microscopio de disección.
Al día siguiente, compruebe si los ensamblajes se han asentado y estabilizado bajo un microscopio de disección. Agregue 750 microlitros de medio de cultivo para llevar el volumen total a un mililitro por pocillo y deje la placa sin tocar durante al menos dos días en la incubadora. Cada semana, retire cuidadosamente 500 microlitros de medio de cultivo de cada pocillo e introduzca 700 microlitros nuevos de medio basal neurofisiológico en cada pocillo.
Se observó un aumento de la duración de la explosión de la red en el día 92 en comparación con el día 78, probablemente debido a la maduración de las neuronas. La actividad celular y de red se desvaneció lentamente en el día 125.
