Mantenga las células madre pluripotentes o PSC en placas de cultivo de seis pocillos y confirme la densidad celular bajo un microscopio. Para la diferenciación de cardiomiocitos o CM, siembre las PSC en una placa de cultivo de 96 pocillos en un medio de preparación de PSC. En la primera etapa de la diferenciación cardíaca, cuando las PSC alcanzan una confluencia del 80 al 90%, cambie el medio a un medio de diferenciación CM con una CRI de dos a 20 micromolares.
Después de 24 a 48 horas de tratamiento con CHIR, cambie el medio a un medio de diferenciación de CM fresco. En la etapa dos o el día tres, reemplace el medio con el medio de diferenciación CM suplementado con cinco micromolares IWR1 en cultivo hasta el día cinco. A continuación, cambie el medio al medio de diferenciación CM y manténgalo hasta los días seis o siete, cuando las PSC se diferencian en células progenitoras cardíacas, o CPC.
En el día 10 o el día 12, fije las células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. En el momento de la tinción, tratar las células con una solución permeable durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar la muestra con el anticuerpo primario CTNT durante la noche a cuatro grados centígrados.
A continuación, tratar la muestra con anticuerpos secundarios en PBS que contengan 1% de albúmina sérica bovina durante una hora a 37 grados centígrados. Después de eliminar el anticuerpo secundario de las células, tiñe los núcleos con Hoechst durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego enjuague las celdas tres veces con PBS antes de agregar 100 microlitros de PBS por pocillo para evitar que se sequen.
Para recopilar imágenes de campo claro e inmunofluorescentes CTNT de diferentes etapas de diferenciación utilizando un microscopio automatizado que admita el cultivo de células vivas, abra el software y cree un nuevo diseño experimental. Elija un objetivo de 5X y una mezcla de 2X2 para la obtención de imágenes. En el menú de canales, agregue el canal de campo claro TL para campo claro y los canales AF 488 y H 33 42 para imágenes de inmunofluorescencia.
Modifique la trayectoria de la luz en la configuración de imágenes. En el menú de la pila Z, establezca el número de segmentos e intervalos al escanear. En la ventana de navegación y mosaicos, configure las regiones de mosaicos por portador y establezca 25 mosaicos de cinco columnas en cinco filas para un pozo.
Para adquirir imágenes, primero coloque la placa de cultivo celular en la bandeja de muestras y cargue la bandeja dentro del microscopio. Si la muestra consta de células vivas, abra el sistema de calefacción y la bomba de dióxido de carbono para mantener las condiciones adecuadas para el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Abra el proyecto experimental preestablecido.
Abra el menú de mosaicos y calibre la posición de la placa manualmente. En la ventana de navegación y teselas, seleccione los pozos necesarios y haga clic en crear para construir regiones de teselas para estos pozos. Haga clic en Verificar regiones de mosaicos en el menú de mosaicos y ejecute el enfoque automático para verificar todos los pozos.
A continuación, corrija manualmente el enfoque de cada pozo. Haga clic en el botón Iniciar experimento y espere a que se generen imágenes automáticas. Por lo general, se tarda aproximadamente 1,2 horas en escanear una placa de cultivo completa de 96 pocillos.
En el marco de procesamiento, elija exportación de imagen, seleccione el tipo de archivo del formato TIFF sin comprimir o el formato PNG y aplíquelo.
