Para obtener macrófagos de la médula ósea de un ratón adulto de tipo salvaje, coloque las células de la médula ósea en una placa de fondo plano tratada ópticamente de 96 pocillos que contenga DMEM suplementado con 10% de FBS y 10% de LCCM. Incubar las células a 37 grados centígrados con 7% de dióxido de carbono durante 10 días. Después de la diferenciación, pipetear 75 microlitros de la suspensión de Mycobacterium abscessus en los pocillos que contienen macrófagos.
Incubar las células a 37 grados centígrados con 7% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Utilizando un dispensador de reactivos de microplaca, equipado con un casete pequeño, agregue 110 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 10% de LCCM en las columnas de control de compuestos o solventes. Dispensar 104 microlitros adicionales de DMEM suplementados con 10 % de FBS y 10 % de LCCM en las columnas que contengan la concentración más alta del compuesto o disolvente.
Ahora pipetee 5,9 microlitros de los compuestos o solventes en sus pocillos designados en las columnas. Con una micropipeta multicanal, realice dos diluciones en serie para cada compuesto y disolvente. Después de la última dilución, deseche los 110 microlitros sobrantes de medio del último pocillo.
Agregue 110 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 10% de LCCM en todas las columnas, excluyendo los pocillos en blanco. Prepare una solución de claritromicina a una concentración de dos microgramos por mililitro en un DMEM. Después de la incubación, retire de la incubadora la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos infectados.
Con una lavadora de placas, lave las celdas tres veces con 200 microlitros de solución de lavado para infecciones. Transfiera 200 microlitros de los compuestos a la placa que contiene los macrófagos infectados. A continuación, añada 200 microlitros de medio de cultivo celular suplementado y solución de claritromicina a sus respectivos pocillos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados con 7% de dióxido de carbono durante 48 horas. Después de la incubación, lavar las células infectadas tres veces cada una con 200 microlitros de la solución de lavado de los compuestos. Con una micropipeta multicanal, dispense 200 microlitros de solución de fijación en todos los pocillos e incube durante 10 minutos.
Después de lavar las celdas, transfiera 200 microlitros de solución permeable a todos los pocillos e incube durante 15 minutos. A continuación, aspire la solución permeable antes de agregar 100 microlitros de la solución de tinción en todos los pocillos. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de la incubación, lave las células tres veces con 200 microlitros de la solución de lavado del compuesto. Para cribar la placa utilizando un sistema de imágenes de alto contenido, seleccione el Tipo de placa como placa de 96 microtítulos. Objetivo como 20X con apertura numérica de 0.4 y Modo a Confocal.
A continuación, seleccione el canal DAPI, CellMask deep red y mCherry para capturar los núcleos teñidos, el citoplasma y la señal de bacterias, respectivamente. Seleccione los pocillos de la placa y los campos respectivos de cada pocillo para el análisis. A continuación, haga clic en la prueba y capture una imagen para verificar la configuración.
Por último, configure un robot de manipulación de equipos para automatizar la adquisición de imágenes durante la noche. Este brazo robótico intercambia las placas en el sistema de imágenes de alto contenido sin intervención humana. Los compuestos daunorrubicina, doxorrubicina, tiostreptón, epirrubicina y pamoato de pirvinio fueron tóxicos para los macrófagos infectados con micobacterias, lo que condujo a menos del 85% de viabilidad celular.
Los compuestos moxalactama y besifloxacina tuvieron menos del 50% de viabilidad de micobacterias a 13,3 micromolares, pero no mostraron diferencias significativas con el control de DMSO. Los compuestos cefdinir, gatifloxacino y moxifloxacino fueron potentes contra las micobacterias intracelulares a 13,3 micromolares, siendo el compuesto pamoato de pirvinio el más activo. Los compuestos, roxitromicina, claritromicina y rifabutina mostraron una potencia extrema contra las micobacterias intracelulares, con claritromicina reduciendo la viabilidad de las micobacterias a menos del 10% en todas las concentraciones.
