Estamos en deuda con Stephan Schwartz y Christian Gutzen de Biobserve GmbH por patrocinar este artículo y de asistencia técnica mucho más. Damos las gracias a Olivia Ochoa, Kaufman cristiana, y Zachary Cress de ayuda con el cuidado de peces, estamos agradecidos con el gobierno federal mexicano permiso para recoger los peces. Estamos en deuda con Glen Vigus, Parke Frederic, y el Laboratorio de Visualización de la Texas A &amp; M. Athena Mason y Easterling Ryan asistencia en la preparación de esta publicación. El financiamiento fue proporcionado por la Universidad Texas A &amp; M y la NSF IOS-1045226.

1. La configuración del hardware y el sistema de visor. El sistema consta de un tanque de pruebas, flanqueada por dos monitores. Una cámara de vídeo conectada al sistema de Visor de BIOBSERVE registra el movimiento del sujeto en tiempo real. Los datos de movimiento se pasa a la reproducción de vídeo interactivo (IVP) del programa en un servidor independiente, lo que determina el movimiento de los estímulos animados en pantalla. <ol><li> Coloque dos monitores CRT en los extremos opuestos de un acuario de 80 litros llena de agua limpia, y la salida coincide monitor. </li><li> Superiores al de la cámara para capturar la vista del acuario, conectarse a BIOBSERVE tarjeta de vídeo. </li><li> Configurar el sistema de visor para recibir información de seguimiento de la cámara. </li><li> Habilitar plug-in en el Visor de que envía las coordenadas del hocico del animal, el cuerpo y la cola en el servidor de la animación en tiempo real a través de una dirección IP de red especificado. </li><li> A su vez en el servidor de animación. </li></ol> 2. Calibración. <ol><li> En el servidor de la animación, abra InteractiveDisplaySetup.txt. Introduzca el ancho de la pantalla y la altura en píxeles en pantalla &quot;Supervisión de la información&quot;. En &quot;ProgramType&quot; entrar &quot;calibración&quot;. Guardar los cambios al archivo. </li><li> Haga doble clic en el icono del programa IVP para iniciar el programa. </li><li> Entrar en la extensión de las dimensiones del depósito según lo establecido en el sistema de visor en el paso 2.3. Esto asegurará la correspondencia entre los datos del visor y la salida interactiva de IVP. </li><li> Desde los extremos de los tanques de peces son más pequeños que los monitores, el software permite al usuario utilizar el teclado (a la anchura y s, z, x la altura, y las teclas de posición) para mover el área de visualización (ventana) de la estímulos para alinearse con los extremos de los tanques de prueba. Visto en el servidor de la animación, la ventana de color rosa se hizo eco en el monitor de una prueba y la ventana azul en la otra (figura 1). </li><li> Utilice Z y X en el teclado para la escala de la visualización de los peces machos en ambas ventanas hasta que coincida con el tamaño del estímulo deseado. </li><li> Mueve las cajas muestra para que se alinee con los bordes de la prueba del tanque. El usuario utiliza las teclas Q y W para mover las cajas hacia o desde el centro del pescado. </li><li> Ingrese la información experimento cuando se le solicite por el programa. El usuario tiene la opción de seleccionar entre los modelos precargados (en nuestra demostración, el cortejo masculino birchmanni Xiphophorus, X. malinche). Asimismo, el usuario especifica el comportamiento de cada uno de los peces en cada etapa (no interactivo o interactivo), y el lado del escenario en el que cada estímulo aparecerá, y el tamaño deseado (longitud estándar) de cada estímulo. </li><li> La siguiente pregunta es si el usuario quiere que el desplazamiento de los peces que se refleja, es decir, que el movimiento del modelo a cada lado del acuario será exactamente lo mismo. Esto sólo se usa cuando los peces están en modo de animación. Las últimas preguntas se refieren al movimiento de la aleta dorsal. El usuario puede seleccionar por defecto dorsal, lo que haría que el dorsal sólo aumentan en un cortejo lateral. Si el dorsal no está definido como predeterminado, el usuario puede decidir si el modelo plantea su aleta dorsal, según la distancia del sujeto desde el monitor. </li></ol> 3.Starting IVP para la prueba de mate-elección. <ol><li> InteractiveDisplaySetup.txt abrir y configurar &quot;ProgramType&quot; a liveTesting y establecer &#39;experimentName&#39; al nombre del mismo archivo que contiene los datos del experimento. </li><li> Con cuidado, coloque los peces en el acuario tema y esperar 10 min. </li><li> Inicie el visor de 2,0 y el IVP. </li></ol> 4. Mate-elección juicio. La secuencia experimental general sigue estudios previos no interactivo estímulos de vídeo 1.4. Las mujeres se presentan con dos estímulos diferentes en los monitores en los extremos opuestos de un acuario de la prueba. Comportamiento de la mujer se hace un seguimiento en tiempo real por el sistema del Visor de Biobserve. El ensayo de respuesta es el tiempo de asociación, la cantidad de tiempo que una mujer gasta menos de 10 cm de un monitor u otro. Tiempo de asociación se calcula automáticamente por el espectador. <ol><li> Los estímulos de vídeo se muestran a los sujetos en un ensayo que consiste en dos etapas de 20 minutos. Una etapa se compone de cuatro segmentos de 5 minutos: <ol><li> El primer segmento se aclimata a la hembra en el tanque de prueba durante cinco minutos, mostrando una pantalla monocromática en ambos monitores. </li><li> En el segundo segmento, dos estímulos diferentes de vídeo se muestran a la mujer, uno en el monitor de la izquierda y el otro a la derecha durante cinco minutos. </li><li> Inmediatamente después de la presentación de los estímulos de vídeo, una pantalla monocromática aparece de nuevo en ambos monitores durante cinco minutos. </li><li> En el cuarto y último segmento, los estímulos del segundo segmento se presentan, pero la posición de cada estímulo se cambió. Esto proporciona un control dentro de la hembra para el sesgo lateral. </li></ol></li><li> El segundoetapa OND repite el mismo patrón, con un conjunto diferente de los estímulos presentados simultáneamente. </li><li> Los ensayos adicionales están a cargo de regresar al paso 2 y variar sistemáticamente lado y el orden de presentación. </li></ol> 5. Los resultados representativos. Se evaluó la eficacia de la reproducción interactiva mediante la comparación de la respuesta femenina a animaciones interactivas y no interactivas de los hombres del cortejo. El estímulo no interactivo realizado un estímulo de cortejo en la pantalla, independientemente del comportamiento de la mujer, al igual que en estudios previos 1-4. El estímulo interactivo seguimiento a la posición horizontal de la mujer a través de la pantalla. La posición de cualquiera de los peces simulado o el pez sujeto se define operacionalmente como el punto medio de la línea que conecta el centro de gravedad y el hocico. Las tres reglas que guían el comportamiento masculino fueron los siguientes, en la dirección X se refiere a la longitud del tanque, y la dirección Z se refiere a la anchura del tanque (figura 2): Regla 1: Los hombres simularon siempre sigue el tema a través de la pantalla, el seguimiento de ella en la dirección Z. Regla 2: la aleta dorsal del macho simulada sólo se provoca cuando se está llevando a cabo un ritual de cortejo lateral. Regla 3: El pez simulado xipho hombres sólo llevará a cabo un ritual de cortejo lateral para el 50% del tiempo total que se muestra a la mujer. El cortejo lateral es provocada por los peces machos que dentro de un cuarto de la longitud del cuerpo masculino de la hembra en la dirección Z. El cortejo lateral es independiente de qué tan cerca de la hembra es el monitor en la dirección X. El estímulo interactivo seguido de cerca la posición de la mujer en tiempo real (figura 3). El trabajo previo que no se usen interactivo estímulos 4,5 mostraron que las mujeres X. birchmanni prefieren claramente las señales visuales de su propia especie. Los estímulos no-interactivo creado por el IVP eran igualmente efectiva para producir preferencias conspecific mate (t = 1,923, N = 9, p = 0,046). Cuando las hembras se pusieron a prueba en la simulación de los hombres interactivo misma especie y heterospecific inmediatamente antes o después en el mismo juicio, sin embargo, no muestran una preferencia (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Monitor de configuración para la calibración. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema del tanque y la configuración del monitor, indicando los ejes se utiliza para describir la posición. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Posición horizontal del modelo de animación y sujeto femenino representante en el tiempo. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Tiempo Association (s) de las mujeres con interactivas y no interactivas de estímulos masculinos misma especie y heterospecific. Cada parcela se crea a partir de un registro de cinco minutos de la salida de las posiciones por el prototipo. En estas parcelas, el tiempo avanza en la dirección Y vertical de 0 a 5 minutos. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Representante de los datos de tiempo y el seguimiento de la asociación de dos estímulos interactivos. Dos segmentos de cinco minutos para dos mujeres se muestran.

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	<li>Fisher, H. S., Mascuch, S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+male+traits+misalign+with+multivariate+female+preferences+in+the+swordtail+fish,+Xiphophorus+birchmanni.">Multivariate male traits misalign with multivariate female preferences in the swordtail fish, Xiphophorus birchmanni.</a> Anim. Behav. 78, 265-269 (2009).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hungry+females+show+stronger+mating+preferences.">Hungry females show stronger mating preferences.</a> Behavioral Ecology. 17, 979-981 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+swordtails+court+with+an+audience+in+mind.">Male swordtails court with an audience in mind.</a> Biology Letters. 3, 5-7 (2007).</li><li>Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+disdain+for+swords+in+a+swordtail+fish.">Female disdain for swords in a swordtail fish.</a> American Naturalist. 167, 136-140 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+chemical+environment+disrupts+communication+in+a+freshwater+fish.">Alteration of the chemical environment disrupts communication in a freshwater fish.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273, 1187-1193 (2006).</li><li>Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+considerations+and+techniques+for+constructing+video+stimuli.">Design considerations and techniques for constructing video stimuli.</a> Acta Ethol. 3, 49-54 (2000).</li><li>Turnell, E. R., Mann, K. D., Rosenthal, G. G., Gerlach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+zebrafish+(Danio+rerio)+analyzed+with+video-stimulus+techniques.">Mate choice in zebrafish (Danio rerio) analyzed with video-stimulus techniques.</a> Biol. Bull. 205, 225-226 (2003).</li><li>Rosenthal, G. G., Ryan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assortative+preferences+for+stripes+in+danios.">Assortative preferences for stripes in danios.</a> Animal Behaviour. 70, 1063-1066 (2005).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocks,+herds+and+schools:+A+distributed+behavioral+model.">Flocks, herds and schools: A distributed behavioral model.</a> , 256 (1985).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steering+Behaviors+For+Autonomous+Characters.">Steering Behaviors For Autonomous Characters.</a> , (1999).</li><li>Hoare, D. J., Couzin, I. D., Godin, J. -. G. J., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+group+size+choice+in+fish.">Context-dependent group size choice in fish.</a> Animal Behaviour. 65, 663-669 (2004).</li><li>Hoare, D. J. &. a. m. p. ;. a. m. p., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+organisation,+shoal+structure+and+information+transfer.">Social organisation, shoal structure and information transfer.</a> Fish and Fisheries. 4, 269-279 (2003).</li></ol>

La producción de este video-artículo fue patrocinado por la investigación Biobserve.

Los métodos anteriores para la reproducción de vídeo interactivo en el comportamiento de los animales se han basado en un operador humano para dar respuestas a las señales del comportamiento de los sujetos. Con IVP, hemos creado un programa que aplica reglas basadas en la interactividad, en respuesta a tiempo real, de datos automatizada sobre el comportamiento de sujetos. Brevemente se describen los pasos necesarios para crear el programa más adelante. El primer paso fue la creación digital de ejemplares macho de X. birchmanni y X. malinche. Tomamos un enfoque similar al de estudios anteriores 6. Hemos creado mallas 3D que siguen el modelo de texturas a partir de fotografías reales de X. birchmanni y X. malinche. Para capturar las texturas realistas de los peces reales, las mismas fotografías utiliza para modelar las formas de peces fueron utilizados como texturas para los peces. Un mapa plano aplicado a sus coordenadas UV alineado el mapa UV con la textura de la fotografía. En segundo lugar, la malla de peces digitales debe deformarse como un pez real. Para lograr esto, un esqueleto virtual fue creado para el cuerpo y las aletas y la &quot;piel&quot; de la malla. El proceso de pelado permite que la malla se deforma cuando se rotan las articulaciones. En segundo lugar, añadió el movimiento de los peces digital. Seis movimientos clave que un pez macho hace xipho fueron animados. Tres de los movimientos fueron utilizados para representar las diferentes velocidades a la que un pez nadar. Los otros tres movimientos eran los peces que quedan aún, girar, o exhibiendo un cortejo lateral. Ya que los machos pueden aumentar o disminuir su aleta dorsal, de acuerdo a si los receptores de hombres o mujeres están presentes 3, desacoplado del movimiento de la aleta dorsal de la del cortejo lateral. La aleta dorsal se impide que se pueda subir o bajar en cualquier momento durante el ciclo. Un total de ciclos de animación veinticuatro fueron utilizados. Cada ciclo se inició y terminó con los peces en la misma postura para que los ciclos de animación fácilmente se pueden mezclar entre sí. Todos los ciclos de animación veinticuatro fueron creados por rotoscopia 7,8 el movimiento deseado del video de arriba de un vivo, el cortejo masculino X. birchmanni. En tercer lugar, permitió la interactividad. Se utilizó el sistema del Visor de Biobserve para realizar un seguimiento en tiempo real la posición de la boca, el cuerpo y la cola de la hembra xipho y transmitir esa información en tiempo real para el programa de IVP. Esto se hizo por separado para cada macho corteja en cada monitor. La animación masculina seguido la posición del pez sujeto. Modelamos siguientes con Reynolds llegó a 9,10 comportamiento de la dirección, lo que permitió a los hombres a seguir a la hembra y desacelerar al acercarse a la mujer. Para calcular la posición de los peces xipho macho en cada paso de tiempo, el sistema se suministra con la posición actual de la mujer, lo que permitió que el programa para calcular las fuerzas que impulsan la masculina. En primer lugar, el vector objetivo de compensación se calcula restando la posición de los peces machos de la posición de la hembra. En segundo lugar la distancia de los peces machos que la hembra se determinó mediante la adopción de la magnitud del vector objetivo de compensación. En tercer lugar, la velocidad deseada de los peces de sexo masculino se determinará dividiendo la distancia por un valor de deceleración constante. Esto permitió a los peces machos de frenar cuando se acercaba a la hembra. Por último, la aceleración deseada se calcula restando velocidad de la corriente de los machos de la velocidad deseada. Dado que las animaciones se representan como cuadros discretos de vídeo a 60 Hz, los cálculos se hicieron en cada paso de tiempo discreto, a intervalos de 0,016 segundos. Velocidad máxima se establece en un valor de 10 cm / s para estos experimentos. Si la magnitud de la nueva velocidad es mayor que la velocidad máxima, la velocidad se fija en el máximo. Para esta simulación particular, los peces machos interactiva elevó su aleta dorsal 50% de las veces, y sólo durante las interacciones de cortejo. El comportamiento de cortejo pantalla lateral se activa cuando el estímulo masculino fue de 0,25 longitudes de cuerpo de los peces xipho mujeres en la dimensión Z. Nos sorprendió que la interactividad abolido la preferencia de las hembras de su misma especie, a pesar de que las animaciones no interactivas provocó una fuerte preferencia y dado que las mujeres pasaron la mayor parte del tiempo la asociación con los estímulos interactivos. Una posibilidad es que sigue de cerca la hembra puede anular las señales visuales que se utilizan para evaluar los hombres, como la espada y la aleta dorsal. Por otra parte, las mujeres pueden ser menos propensos a perder el interés en un hombre de cortejo, y por lo tanto es menos probable que los individuos de la muestra (figura 5). Sin embargo, nuestros resultados muestran que el principio de funcionamiento de la tecnología de vídeo-juego es decir, basada en software, basado en normas agentes que respondieron a la entrada del usuario puede ser aplicado con éxito en reproducción interactiva en los estudios decomportamiento de los animales. Este tipo de normas basadas en la reproducción interactiva puede ser muy útil para los estudios de movimiento de bancos de arena y colectiva 11,12. En particular, la capacidad de manipular las reglas que un modelo virtual utiliza para bancos de arena que nos ayudan a comprender los procesos que los animales utilizan para tomar decisiones de bancos de arena.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Maya 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C# program using Microsoft&#x2019;s XNA Game Studio 2.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BIOBSERVE Viewer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell 15&#x201D; CRT monitor (2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 X 20 X 80 cm Plexiglas testing aquarium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell Latitude computer (animation server)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated interactive video playback for studies of animal communication

La reproducción de vídeo es una técnica ampliamente utilizada para la manipulación controlada y la presentación de las señales visuales en la comunicación animal. En particular, basadas en parámetros animación por ordenador ofrece la oportunidad de manipular de forma independiente un número de características de comportamiento, morfológicos o espectrales en el contexto de imágenes realistas, movimiento de animales en la pantalla. Una limitación importante de la reproducción convencional, sin embargo, es que el estímulo visual carece de la capacidad de interactuar con el animal vivo. Los préstamos de la tecnología de video-juego, hemos creado un sistema automatizado e interactivo para la reproducción de vídeo que controla las animaciones en respuesta a señales en tiempo real de un sistema de seguimiento de vídeo. Hemos demostrado que este método mediante la realización de la elección de pareja en los ensayos de pescado xipho hembra, Xiphophorus birchmanni. Las mujeres se les dio una elección simultánea entre un hombre corteja misma especie y un macho corteja heterospecific (X. malinche) en los lados opuestos de un acuario. El estímulo masculino virtual fue programado para seguir la posición horizontal de la hembra, los machos cortejando a hacer en la naturaleza. La elección de pareja en los ensayos silvestres X. mujeres birchmanni fueron utilizados para validar la capacidad del prototipo para generar efectivamente un estímulo visual realista.

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Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Reproducción de vídeo es una técnica ampliamente utilizada en el comportamiento animal. Hemos creado y evaluado un programa que se aplica basado en normas, reproducción interactiva de 3-D animaciones por ordenador, en respuesta a tiempo real, de datos automatizada sobre el comportamiento de sujetos.

Reproducción automática de vídeo interactivo de Estudios de la Comunicación Animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

automated-interactive-video-playback-for-studies-animal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K vistas.  Texas A&M University (TAMU). Reproducción de vídeo es una técnica ampliamente utilizada en el comportamiento animal. Hemos creado y evaluado un programa que se aplica basado en normas, reproducción interactiva de 3-D animaciones por ordenador, en respuesta a tiempo real, de datos automatizada sobre el comportamiento de sujetos.

Video: Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigación

Neurociencias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Animal entero fijación por perfusión de los roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Vídeo-oculografía en ratones

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment and Communication for People with Disorders of Consciousness

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the level of consciousness of people unable to provide motor response and, in a second stage, establishing a communication channel for these people that enables them to answer questions with either &#39;yes&#39; or &#39;no&#39;. The suite of paradigms is designed to test basic responses in the first step and to continue to more comprehensive tasks if the first tests are successful. The latter tasks require more cognitive functions, but they could provide communication, which is not possible with the basic tests. All assessment tests produce accuracy plots that show whether the algorithms were able to detect the patient&#39;s brain&#39;s response to the given tasks. If the accuracy level is beyond the significance level, we assume that the subject understood the task and was able to follow the sequence of commands presented via earphones to the subject. The tasks require users to concentrate on certain stimuli or to imagine moving either the left or right hand. All tasks are designed around the assumption that the user is unable to use the visual modality, and thus, all stimuli presented to the user (including instructions, cues, and feedback) are auditory or tactile.

With this experiment, one might be able to detect consciousness in people with disorders of consciousness. Furthermore, the approach can create a simple communication channel that enables people to give simple YES/NO answers to questions.

Evaluación y comunicación para las personas con trastornos de la conciencia

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Administración exógena de alfa-sinucleína asociada a microsomas agregados a las neuronas primarias como un modelo de celular de gran alcance de la formación de las fibrillas de

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...