Expresamos nuestro agradecimiento a Woo-Jin Chang para proporcionar los canales trifurcating para DEP actuación y Mitchell Collens por su ayuda en la configuración del equipo. El trabajo ha sido financiado por EE.UU. NSF a través de subvención OISE-0951647 y por el Consejo de Seguridad Nacional de Taiwán a través de subvención 99-2911-1-002-007.

Un esquema general de la instalación del equipo se muestra en la Figura 1. El conjunto de PCB de la muestra se detalla en una sección transversal esquemática en la Figura 1B. 1. Preparación de electrodos PCB: <ol><li> Diseño de PCB electrodos a la geometría deseada para generar un campo eléctrico no uniforme. Fichas personalizadas electrodo PCB pueden ser ordenados a través de instalaciones de fabricación comercial (fig. 1C). </li><li> Prepare prefabricados electrodos PCB por soldadura de calibre 16 alambre al final de cada electrodo de metal impreso (Figura 1D). <ol><li> Coloque el cable en el extremo del electrodo. Mantener el alambre en su lugar en el área de metal de la placa con el hierro candente de soldadura para calentar el alambre. </li><li> Alimentar a una pequeña cantidad de estaño en el alambre caliente para llenar el alambre con soldadura. </li><li> Después de que el cable está llena de soldadura, retire el soldador y sujeta el cable en su lugar, mientras que la soldadura se enfría. </li></ol></li><li> Repita el proceso de soldadura para cada conexión eléctrica en el circuito impreso (Figura 1D). </li></ol> 2. Preparar canales de microfluidos: <ol><li> Polidimetilsiloxano (PDMS) basado en los canales de microfluidos se preparan con el elastómero PDMS, Sylgard 184 de Dow Corning. Un molde maestro que define los canales generalmente se crean a través de procesos de microfabricación estándar con una oblea de silicio y SU-8 fotosensible. </li><li> Mezcla de compuesto de base para el agente de curado en una proporción de 10:1 durante 5 minutos. </li><li> Vierta el líquido de PDMS sobre el molde prefabricado SU-8 maestros y eliminar las burbujas de aire mediante la exposición de PDMS líquido al vacío durante unos minutos. Repita el proceso de vacío, si es necesario para eliminar por completo todas las burbujas. </li><li> Curar el PDMS a 70 ° C durante 2 horas. </li><li> Quitar la losa PDMS con canales de microfluidos de la oblea con una cuchilla de afeitar, cuidado de no romper la oblea. </li><li> Hacer agujeros para la introducción de líquidos y las células en el dispositivo de microfluidos. (Nota: jeringa de bombeo, gravedad o la tensión superficial basado en el flujo se pueden usar con DEP). </li><li> Inspeccionar el dispositivo de microfluidos para asegurarse que esté libre de polvo y escombros. Limpieza del PDMS se puede lograr fácilmente con la cinta 3M Scotch Magic. </li><li> Plasma de bonos de la PDMS microfluidos canales para una limpieza no.0 espesor (80 a 130 micras) cubreobjetos. Calentar el conjunto de cubreobjetos-microfluidos a 100 ° C por un mínimo de 15 min. </li></ol> 3. Preparar de muy baja conductividad medios de comunicación: <ol><li> De baja conductividad, los medios de comunicación se prepara mezclando 8,5% de sacarosa + 0,3% de glucosa (w / v) en agua desionizada (DI) 1. Nota:. Hemos demostrado previamente que las células pueden ser cultivadas durante varios días en los medios de comunicación convencionales de cultivo de células después de ser expuesto a la baja conductividad por periodos cortos (de aproximadamente 30 min) 11 </li></ol> 4. Montar canales de microfluidos sobre electrodos PCB: <ol><li> Coloque una pequeña cantidad (aproximadamente 10 l) de aceite mineral en el PCB para asegurar un contacto estrecho entre el PCB y el cubreobjetos. Nota: Un paso opcional para la disminución de la visualización del electrodo consiste en recubrir la superficie de la PCB con una capa muy delgada de marcador negro permanente o pintura. </li><li> Coloque el montaje del canal de microfluidos cubreobjetos, en el PCB engrasada, con el contacto cubreobjetos formando con el aceite (cubreobjetos hacia abajo). Presione suavemente el cubreobjetos-montaje de microfluidos hacia abajo para asegurar un buen contacto y para minimizar las burbujas de aire que pueden ser nocivas para la célula y la visualización de cuentas. Un ejemplo del dispositivo completo se muestra en la Figura 1D. </li></ol> 5. Ordenar y concentrado de Cuentas y las células con DEP: <ol><li> Llenan los canales de microfluidos con agua destilada o de los medios de comunicación de baja conductividad, el proceso de unión de plasma facilita la carga fácil de las soluciones acuosas en los canales de microfluidos con carácter temporal, haciendo que la superficie PDMS normalmente hidrofóbicas hidrofílicos. </li><li> Introducir las células y / o cuentas de poliestireno en el depósito del canal (fig. 1C). Aquí se utiliza el adenocarcinoma de colon humano (HT-29) las células. </li><li> Conecte la salida de un generador de funciones a la entrada de un amplificador de corriente, conectar la salida del amplificador a los cables de los electrodos. Cubrir todos los cables eléctricos y las superficies de la instalación con cinta aislante para proteger a los usuarios de la exposición potencial a los golpes. Un diagrama esquemático de la instalación del equipo se muestra en la Figura 1. </li><li> Ajuste el generador de funciones para producir una salida de onda sinusoidal de 1.0 a 1.5 MHz. La amplitud de la salida debe ser ajustado por el amplificador de potencia RF para producir una potencia de 80-100V a la PCB. El amplificador de potencia RF en este trabajo requiere una tensión de entrada alrededor de 220 a 330 mV. Para separar las células y los granos, la tasa de flujo laminar debe ser compatible con la fuerza de DEP para mover las células y los granos en el canal principal (ancho w = 100 m, la altura h = 27 m) en los canales de destino (ancho w = 100 m , la altura h = 27 mm). Atención: consultar con el fabricante de PCB para determinar el mvoltajes MÁXIMO operativo para evitar problemas como el sobrecalentamiento de PCB o de fusión. Revise las especificaciones del fabricante del equipo para el generador de funciones y los fabricantes de amplificadores de potencia para determinar los ajustes de operación seguras. </li><li> DEP iniciar a las células de tipo y los granos. Las células de una experiencia positiva-DEP, mientras que bolas de poliestireno experiencia negativa-DEP en un campo eléctrico no uniforme dentro de las frecuencias especificadas. Esto permite que el DEP-fuerza activa bioactuation y la separación de las células y otras partículas dentro de los dispositivos de microfluidos con PCB accesibles y reutilizables como electrodos. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Cuando DEP es eficaz en las células de accionamiento o partículas, una alineación sólida dentro de no uniforme campos eléctricos se observa para los baños de estática o bajas velocidades del fluido. En condiciones de velocidades del fluido más alto, el comportamiento de las células o partículas depende de la orientación relativa del flujo axial para el campo eléctrico y la velocidad del flujo. Además, el comportamiento de células y partículas que también dependen de la intensidad de campo eléctrico y el grado de falta de uniformidad en el campo eléctrico. Los comportamientos característicos de las células o partículas son &quot;cadenas de perlas, de ciclismo, pararse o girar. Condiciones que ponen en peligro o suprimir DEP incluyen la presencia de sales y otras moléculas en el líquido iónico, la fuerza débil campo eléctrico, las velocidades de flujo excesivo, cubreobjetos que son demasiado gruesas, o soluciones conductora entre el cubreobjetos y electrodos PCB (por ejemplo, un cubre grietas pueden inducir la mezcla de agua y el aceite mineral). En este caso, cuando se utiliza no.0 cubreobjetos espesor (80 a 130 micras) y una distancia entre electrodos de (231 m), el gradiente de la plaza de la intensidad del campo eléctrico aplicado a la células HT-29 y los granos se estima que entre 2 -8-6 -8 V 2 / m 3 1. La fuerza de DEP se puede estimar mediante la medición de la velocidad de la partícula, manipulado por el DEP en el fluido estático (Figura 2A-B). Debido a la pequeña inercia de la partícula y el medio ambiente de alta viscosidad del canal de microfluidos, la fuerza de arrastre hidrodinámico será igual, pero en dirección opuesta, con la fuerza de DEP. La velocidad media en el cordón de baja conductividad media es de 34,5 m / s con una tensión DEP de 93 Vpp y banda de 1,5. La fuerza de arrastre hidrodinámico se puede calcular con la siguiente ecuación 1. F = arrastrar 6πηRv El promedio de la viscosidad η de los medios de baja conductividad a 20 ° C es de 1.27 mPa • s y el radio R de cuentas es de 7,5 micras. La fuerza de arrastre hidrodinámico para el poliestireno microesferas se estima en 6,19 pN. Para demostrar la capacidad para actuar dentro de los canales de microfluidos cuentas (Figura 2C-F), se inició el flujo de los medios de comunicación de baja conductividad, mediante el empleo de la tensión superficial mediada por flujo. La velocidad media de cuentas en el canal de entrada única fue 1540 m / seg, mientras que la velocidad media dentro de los canales individuales se redujo a 565 m / seg (Figura 2 C). Al iniciar el DEP, los granos se mantiene en el canal central en lugar de ser liberados en el canal lateral. Así, bajo estas condiciones, las fuerzas DEP fueron suficientes para superar la fuerza de arrastre del fluido en los dos canales laterales. El mismo principio también se utilizó para desviar las cuentas de la cannel central para un canal de una sola cara, simplemente cambiando la orientación de los canales y el flujo de grano a la de los electrodos DEP (Figura 2E-F). Inclinando el electrodo de metal en el lado del canal de entrada única, cuando se inició DEP, las cuentas fueron guiados a la parte del canal que las cuentas se acercó al punto de bifurcación. Allí, las fuerzas DEP bastaban para sacar las cuentas en uno de los canales laterales, donde el flujo laminar continuo para impulsarse por el canal (Figura 2F). Dado que las células y microesferas de poliestireno tienen claras diferencias en su capacidad de ser polarizado y se realiza en no uniforme campos eléctricos, se utiliza DEP para demostrar la capacidad de realizar la separación en el chip de las células y los granos, al mismo tiempo. Se utilizó la misma estructura de canal de microfluidos y los electrodos de PCB como se ha configurado en la figura 2E-F, pero introdujo una suspensión de células HT-29 y los granos en los medios de comunicación de baja conductividad en el canal de entrada única (Figura 3). Cuando se introduce DEP, y en estas condiciones, el HT-29 células se mantuvieron en los dos canales de salida a la izquierda, mientras que las cuentas se mantuvieron en el canal de salida individual, en la derecha. Aquí las células muestran un comportamiento característico &#39;perlas en cadena &quot;, ya que se recogen en el canal de salida izquierdo. De vez en cuando una gota y la célula se adhieren juntas en las que se agrupan, a menudo en los canales de la celda de salida. A partir de este experimentoal de datos, se determina la tasa de clasificación para 713 partículas (las células y los granos) por minuto, o el equivalente a 14.260 células y los granos en 20 minutos. El número de células y los granos recuperados es relevante y útil para la biología molecular, imágenes, bioquímicos y aplicaciones de laboratorio en un chip. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCB-DEP basado en las células y partículas en los canales de microfluidos. (A) La configuración de los equipos de DEP basado actuación comienza con un generador de funciones para definir la frecuencia y la amplitud de la señal eléctrica, y luego un amplificador de potencia para aumentar la potencia de la señal de la campo eléctrico generado en el PCB. (B) El dispositivo de microfluidos para el accionamiento de la muestra se compone de PDMS canales de microfluidos irreversiblemente unido a un no. 0 cubreobjetos espesor (80 a 130 micras) a través de plasma de oxígeno, de medios no conductores a bañarse a las células y / o cuentas. (C) Los electrodos de PCB se utiliza aquí constan de dos regiones en las que los electrodos son interdigitados para generar una fuerte falta de uniformidad del campo eléctrico. (D) El dispositivo completo: una PCB con un dispositivo de microfluidos trifurcada en un cubreobjetos solo recuadro muestra el dispositivo completo con cables de los electrodos. (CD) para la escala, las mediciones de PCB son de 8,4 cm (largo), 2,1 cm (w), con 5 mm de ancho electrodos. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Imágenes representativas de las células y los granos en los canales antes y durante la actuación DEP. (A) 15 m cuentas fluorescentes de poliestireno en una baja conductividad de la solución de medios dentro de un canal de microfluidos PDMS, sin flujo laminar (tiempo transcurrido, 1,23 seg). (B) Al inicio de DEP, las cuentas de migrar hacia los patrones de electrodos PCB (rayas negro) en lugar de entre los electrodos (tiempo transcurrido, 8,18 seg). (C) Cuentas de los mismos canales de bajo flujo laminar se dividen entre los tres canales separados (lapso de tiempo, 5,3 segundos), cuando se inicia el DEP (D), las cuentas se activan a fluir sólo en el canal central (tiempo transcurrido, 4.3 seg). (E) Al cambiar la orientación de los canales de los electrodos de PCB, los granos pueden ser diferencialmente dirigidas hacia los canales laterales (F) con DEP en lugar del canal central, como se muestra en (D). (EF) Tiempo transcurrido es 8,23 segundos y 5,16 segundos, respectivamente. Todas las barras de escala = 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imágenes representativas de las células y los granos en los canales antes y durante la actuación DEP. (AB) Antes de iniciar el DEP, una solución mixta de adenocarcinoma de colon humano (HT-29) las células y el flujo de granos de un canal a 3 canales de salida independientes. La flecha abierta identifica la dirección del flujo laminar y los canales se describen con líneas de puntos para la orientación y aclaración. (CD) por la inducción de DEP, los granos y las células son accionados de forma selectiva en los canales por separado como se identifica. Células HT-29 la salida del canal central e izquierdo, mientras que cuentas salida del canal derecho. Cadena de perlas característicos de los granos y las células se observa durante DEP actuación. (A, C) La interferencia diferencial imagen de contraste de las células y los granos en microcanales hace las cuentas fácilmente visibles. Glow imágenes en escala de intensidad (B, D) de las mismas imágenes DIC (A, C) mejorar la visualización de las células en los canales. Los electrodos de metal reflectante ((A, C) de banda de luz y (B, D) de color amarillo y verde) ofrecen un importante punto de referencia para la alineación de microcanales de los electrodos para la eficacia de DEP basado en actuación. Las barras de escala = 100 micras.

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La manipulación de células en dispositivos de microfluidos es deseable para la clasificación o la colocación selectiva de células individuales o de los estudios de población. 2 flujo laminar se utiliza en combinación con las válvulas y bombas para manipular las células dentro de los dispositivos de microfluidos. Sin embargo, estos métodos sólo son desafiantes y requieren procesos de fabricación detalladas y habilidades 3 centrifugación puede simplificar las exigencias para la colocación de la célula, pero las imágenes simultáneas es un reto. Por otra parte, la arquitectura de canal para la centrifugación se debe considerar con cuidado en el diseño de las manipulaciones deseadas y teniendo en cuenta los efectos las fuerzas centrípetas. 4 pinzas láser se puede utilizar para la colocación de la celda, pero el método es caro y no es susceptible de clasificación de células de alto rendimiento. 5 Sin embargo, el DEP se ha demostrado como un sistema eficaz de &quot;pinzas eléctricas&quot; para la colocación efectiva de células, la caracterización y la manipulación de 6,7. En concreto, el DEP se ha utilizado para la captura selectiva y clasificar las células en el chip de procesamiento de la vida y las células muertas, 7.10 y para recoger las células en los sensores de resonancia para la medición de la masa celular. 11 Hemos demostrado anteriormente que al aumentar la DEP fuerza en las bacterias o los granos por encima de la fuerza de arrastre de fluidos, la concentración en el chip y la captura de perlas de poliestireno y Listeria monocytogenes V7 puede llevarse a cabo. 12 poblaciones mixtas de E. coli y L. monocytogenes bacterias también pueden ser dirigidas y libera a través de pulsos de DEP. Además, las partículas más grandes pueden ser capturados diferencialmente y se concentró en los electrodos basados ​​en el tamaño de las partículas grandes, mientras que las partículas más pequeñas no se captura, pero se eliminan con el flujo de fluidos. 13 Cuando las fuerzas del DEP no superar las fuerzas de fluidos arrastrando las partículas, cordón o de células no es capturado, sino que se desplazaban dentro de la corriente de fluidos. Como se muestra en la Figura 2C, cuentas puede ser enfocada en la región central de la corriente de fluido suficiente para mantener las cuentas en el canal central. Esto podría ser debido al efecto combinado de las influencias de partículas a partículas en el campo eléctrico, las velocidades de fluido superior a DEP fuerzas de arrastre, la combinación de estos, o algún efecto indefinido otros. Más recientes avances en la DEP sin contacto permiten maximizar la captura de células y la manipulación con el campo mínimo requerido, protegiendo así a los tipos de células, en la mayor medida, durante la manipulación DEP. 1,9 DEP contacto promesa ofrece a la comunidad de microfluidos para la clasificación, recolección y colocación células dentro de los dispositivos de microfluidos. Anticipamos que con el aumento de la demanda, y la aplicación de DEP para la manipulación en dispositivos de microfluidos, descubrimientos e innovaciones se ampliará el entendimiento y la influencia de las fuerzas DEP. Los PCB pueden ser fabricados a través de procesos de alto volumen a un precio asequible, con un tiempo de fabricación de respuesta rápida, por lo que buenas plataformas para la comercialización. Además, los PCB son fáciles de usar y accesible para los científicos en una amplia gama de disciplinas para la manipulación de células en el chip y la clasificación. Al diseñar la disposición de los electrodos de PCB, se debe considerar a la partícula deseado / celular trayectoria. Los factores clave a considerar incluyen el tamaño de partícula y el tipo (de cuentas y / o celular), el tipo de células, el tamaño de microcanales, la velocidad del flujo, distancia entre electrodos (que determina la intensidad del campo eléctrico), el espesor de cubreobjetos, y la conductividad del fluido. Estos factores influyen en la fuerza necesaria y disponible para manipular la partícula o célula, y en última instancia, la eficiencia de separación. El protocolo presentado aquí demuestra una configuración eficaz para iniciar DEP para las microesferas y la separación de células. Para posibles aplicaciones, los usuarios deben coincidir con la arquitectura del diseño del canal de microfluidos con las vías de flujo deseado para las células y los granos, así como los patrones de electrodos para optimizar la eficiencia de cada aplicación. Distancia entre electrodos y el espesor de cubreobjetos se puede utilizar de acuerdo a las directrices ya se ha informado en el diseño de la disposición del canal de microfluidos. 1 La conductividad y la permitividad de la célula / partícula y el medio circundante debe ser lo suficientemente diferentes como para facilitar el DEP positivo o negativo, manteniendo las células intactas. La polaridad de DEP para una partícula esférica se puede determinar a partir de la parte real de un valor complejo de las siguientes Clausius-Mosotti factor en el ω la frecuencia de la tensión de DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> La ecuación 1 En esta ecuación ε es la permitividad, σ es la conductividad y permitividad ε * es complejo. Los subíndices p y mdenotan la partícula y los medios de comunicación, respectivamente. Cuando una célula tiene una constante dieléctrica mayor que los medios de comunicación, o la parte real del factor de Clausius-Mosotti es positiva, la partícula se vuelve más polarizado que el medio circundante. Debido a un campo eléctrico no uniforme, la polarización de la partícula se convierte en no-uniforme y esto crea un DEP positivo (+ DEP) la fuerza que atrae a la célula hacia la región con una mayor intensidad de campo eléctrico. Si una celda tiene una constante dieléctrica menor que el medio circundante, o la parte real del factor de Clausius-Mosotti se convierte en negativo, se someterá a DEP negativo (DEP), y la célula se ve obligado hacia la región de campo mínima. Si la célula y los medios de comunicación tienen aproximadamente el mismo complejo permitividad, ninguna fuerza puede generar para manipular la célula. Por esta razón, el agua pura es un medio de comunicación preferido para la manipulación de partículas DEP. Sin embargo, para evitar el estrés osmótico en la célula de agua pura, los medios de comunicación de baja conductividad fue formulado para mantener la conductividad sin cambios, pero para aumentar la osmolaridad para disminuir la presión osmótica en las células. Convencionales medios de cultivo celular o tampones fisiológicos, tales como DMEM o PBS, tiene una alta conductividad, que no es adecuado para la manipulación de DEP. También han demostrado previamente que las células pueden ser capturados en los sensores con DEP con baja conductividad de los medios. Después de un breve período para la adhesión celular, los medios de comunicación de baja conductividad puede ser sustituido por los medios de cultivo de células necesarias para apoyar el crecimiento de células para los días 11. Desde nuestra experiencia, perlas fluorescentes son muy brillantes, con respecto a la fluorescencia de células vivas, por lo que puede ser un desafío para que coincida con la intensidad de cuentas a la intensidad de una célula viva y fluorescentes. Para mejorar la visualización de las células y los granos, se utilizó la microscopía DIC en un microscopio vertical para obtener imágenes de ambos. Para visualizar las células y los granos, se presentaron los datos a una intensidad de brillo-escala de la imagen, que conserva los datos en un amplio espectro de colores para facilitar la visualización. Por lo tanto, al diseñar el estudio de interés, los parámetros de imagen y los recursos deben ser considerados. En resumen, hemos demostrado la capacidad de actuar de forma selectiva las células de los granos y en canales separados con DEP. Con la utilidad cada vez mayor de canales de microfluidos para la biología celular, bioquímica y aplicaciones de la bioingeniería, la DEP es una opción deseable para la recogida de células, la colocación y la clasificación. La fabricación de PCB electrodos es barato y conveniente, los electrodos son fáciles de usar, y los tiempos de fabricación rápida son ideales para la aplicación de la DEP.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard 184 kit (PDMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elsworth Adhesives</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>Dow Corning Sylgard</td>
</tr>
<tr>
<td>16 awg hook-up wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Belden</td>
<td>8521</td>
<td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold seal Cover Glass </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>260320</td>
<td>No. 0 thick, 24 x 60 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Miltex Biopsy Punch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>95039-104</td>
<td>Miltex, assorted sizes</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom PCB electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bay Area Circuits </td>
<td>Custom parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>O121-1 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>House DI water supply</td>
<td>None</td>
<td>Use filtered DI water</td>
</tr>
<tr>
<td>D-Glucose Anhydrous Granular AR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals </td>
<td>4912-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose, Crystal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>8360-06 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent polymer microspheres </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Bangs Laboratories</td>
<td> FS07F/9277</td>
<td>15&mu;m Dragon green microspheres</td>
</tr>
<tr>
<td>HT-29 cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-38D</td>
<td>Human colon adenocarcinoma</td>
</tr>
<tr>
<td>Typsin 0.05% EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>25300054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eclipse E600FN upright microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Nikon</td>
<td>Eclipse E600FN </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phantom V310 High-speed imaging camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phantom</td>
<td> V310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX51 upright research microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus </td>
<td>BX51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpotFlex high resolution color camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diagnostic Instruments </td>
<td>FX1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Function generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent </td>
<td>3325A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RF Power amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EIN</td>
<td>2100L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar flow

Dispositivos de microfluídica han avanzado los estudios de células al brindar un ambiente de fluidos dinámicos en la escala de la célula para el estudio, la manipulación, clasificación y recuento de las células. Sin embargo, la manipulación de las células dentro del dominio fluido sigue siendo un reto y requiere de protocolos complicados de fabricación de válvulas de la formación y los electrodos, o las demandas equipos especiales como pinzas ópticas. Aquí, se demuestra que los circuitos impresos convencionales (PCB) se puede utilizar para la manipulación sin contacto de las células mediante el empleo de dielectroforesis (DEP) para la manipulación de cuentas y de células en los campos de flujo laminar para bioactuation, y para la separación celular y cuenta en microfluidos multicanal dispositivos. En primer lugar, se presenta el protocolo para el montaje de los electrodos de DEP y dispositivos de microfluidos, y la preparación de las células para DEP. Entonces, podemos caracterizar la operación de DEP con perlas de poliestireno. Por último, mostramos los resultados representativos de la separación de cuentas y celular en un dispositivo de microfluidos multicanal. En resumen, el DEP es un método eficaz para la manipulación de partículas (granos o células) en dispositivos de microfluidos.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Dielectroforesis (DEP) es un método eficaz para manipular células. Placas de circuito impreso (PCB) puede proporcionar electrodos de bajo costo, reutilizables y eficaz para el contacto libre de la manipulación de células dentro de los dispositivos de microfluidos. Mediante la combinación de PDMS basado en canales de microfluidos con cubreobjetos sobre los PCB, se demuestra la manipulación de cuentas y la separación dentro de la célula y multicanal dispositivos de microfluídica.

Cuentas de la separación y las células en varios canales de dispositivos de microfluidos Con dielectroforesis y de flujo laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.3K vistas.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Dielectroforesis (DEP) es un método eficaz para manipular células. Placas de circuito impreso (PCB) puede proporcionar electrodos de bajo costo, reutilizables y eficaz para el contacto libre de la manipulación de células dentro de los dispositivos de microfluidos. Mediante la combinación de PDMS basado en canales de microfluidos con cubreobjetos sobre los PCB, se demuestra la manipulación de cuentas y la separación dentro de la célula y multicanal dispositivos de ...

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Investigación

Bioingeniería

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...