1. Preparación del gel <ol><li> Pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz Erlenmeyer. Los geles de agarosa se preparan usando p / v solución porcentaje. La concentración de agarosa en un gel dependerá de los tamaños de los fragmentos de ADN que se separaron, con la mayoría de los geles que oscilan entre 0,5% -2%. El volumen del tampón no debe ser mayor que 1/3 de la capacidad del matraz. </li><li> Añadir tampón de agarosa al matraz que contiene. Agite para mezclar. El gel más común que los amortiguadores son TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) y de TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Fundir la mezcla de agarosa / tampón. Esto se realiza comúnmente mediante el calentamiento en un horno de microondas, pero también se puede hacer sobre una llama de Bunsen. En intervalos de 30 s, retirar el matraz y agitar el contenido para mezclar bien. Repita hasta que la agarosa se haya disuelto completamente. </li><li> Añadir bromuro de etidio (EtBr) a una concentración de 0,5 g / ml. Alternativamente, el gel puede también ser teñidas después de electroforesis en el funcionamiento de un tampón que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio durante 15-30 minutos, seguido de decoloración en la gestión de búfer por un período igual de tiempo. </li></ol> Nota: EtBr es un carcinógeno y debe desecharse de forma adecuada según las regulaciones de la institución. Los guantes deben ser usados ​​siempre al manipular geles que contienen bromuro de etidio. Tintes alternativos para la tinción de ADN se encuentran disponibles, sin embargo EtBr sigue siendo el más popular debido a su sensibilidad y costo. <ol start="5"><li> Dejar que la agarosa se enfríe bien en la mesa de trabajo o por incubación en un baño de 65 ° C el agua. De no hacerlo, se tuerza la cubeta. </li><li> Coloque la bandeja de gel en el aparato de fundición. Alternativamente, también se puede pegar los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Colocar un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos. </li><li> Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Permitir la agarosa para establecer a temperatura ambiente. Retirar el peine y colocar el gel en el cuadro de gel. Alternativamente, la gEl también puede ser envuelto en una envoltura de plástico y se almacenó a 4 ° C hasta su uso (fig. 1). </li></ol> 2. Puesta en marcha de aparato de gel y la separación de fragmentos de ADN <ol><li> Añadir colorante de carga para las muestras de ADN para ser separados (fig. 2). Gel de carga de colorante se hace típicamente en una concentración 6X (0,25% azul de bromofenol, 0,25% cianol xileno, 30% de glicerol). Cargando medio de contraste ayuda a realizar un seguimiento de hasta qué punto su muestra de ADN ha viajado, y también permite que la muestra se hunden en el gel. </li><li> Programa de la fuente de alimentación a la tensión deseada (1-5V/cm entre los electrodos). </li><li> Añadir tampón suficiente corriente para cubrir la superficie del gel. Es importante utilizar el mismo tampón se ejecuta como el utilizado para preparar el gel. </li><li> Coloque los cables de la caja de gel a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y verificar que tanto la caja de gel y la fuente de alimentación están trabajando. </li><li> Retire la tapa. Despacioy cuidadosamente cargar la muestra de ADN (s) en el gel (fig. 3). Un marcador de ADN de tamaño apropiado se deberán colocar siempre junto con las muestras experimentales. </li><li> Sustituir la tapa para la caja de gel. El cátodo (cables de color negro) debe estar más cerca de los pozos que el ánodo (cables rojos). Compruebe que los electrodos se conectan en las ranuras correctas en la fuente de alimentación. </li><li> Encienda la alimentación. Ejecutar el gel hasta que el colorante ha migrado a una distancia apropiada. </li></ol> 3. Observando separados por fragmentos de ADN <ol><li> Cuando se ha completado la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la caja de gel. </li><li> Quitar el gel de la cubeta. Escurrir el exceso de tampón de la superficie del gel. Coloque la bandeja de gel en las toallas de papel para absorber el búfer adicional en ejecución. </li><li> Quitar el gel de la bandeja de gel y exponer el gel a la luz UV. Esto se realiza comúnmente mediante un sistema de documentación de gel (fig. 4). Las bandas de ADN debe mostrararriba como bandas fluorescentes de color naranja. Toma una fotografía del gel (fig. 5). </li><li> Deseche el gel y el tampón de acuerdo a las normas de la institución. </li></ol> 4. Los resultados representativos La figura 5 representa un resultado típico después de electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. Después de la separación, los fragmentos de ADN resultantes son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o escalera debe ser separado a un grado que permita la determinación útil de los tamaños de las bandas de la muestra. En el ejemplo mostrado, fragmentos de ADN de 765 pb, 880 pb y 1022 pb se separó en un gel de agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN de 2-log. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa después de la eliminación del peine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Un estudiante de la adición de colorante de carga a las muestras de su ADN. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Un estudiante cargar la muestra de ADN en un pozo en el gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Un ejemplo de un sistema de documentación en gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. Una imagen de una electroforesis en gel de mensaje. EtBr se añadió a la electroforesis en gel antes a una concentración final de 0,5 g / ml, seguido de la separación a 100 V durante 1 hora. El gel se expone a la luz UV y la imagen tomada con un sistema de documentación de geles.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una manera eficiente y eficaz de separar los ácidos nucleicos. Alta resistencia del gel de agarosa, permite la manipulación de los geles porcentuales bajos para la separación de grandes fragmentos de ADN. Tamizado molecular se determina por el tamaño de poros generados por los haces de agarosa 7 en la matriz de gel. En general, cuanto mayor sea la concentración de agarosa, menor es el tamaño de los poros. Tradicionales geles de agarosa son más eficaces en la separación de los fragmentos de ADN entre 100 pb y 25 kb. Para separar fragmentos de ADN de más de 25 kb, uno tendrá que utilizar campo pulso electroforesis en gel de 6, que implica la aplicación de corriente alterna a partir de dos direcciones diferentes. De este modo grandes fragmentos de ADN de tamaño están separados por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los cambios en la dirección de la corriente. Los fragmentos de ADN más pequeñas que 100 pb se separó más eficazmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. A diferencia degeles de agarosa, la matriz de gel de poliacrilamida se forma a través de una reacción de radicales libres químico accionado. Estos geles son más delgados de mayor concentración, se corren en forma vertical y tienen una mejor resolución. En el ADN moderno secuenciación electroforesis capilar se utiliza, por lo que los tubos capilares se llenan con una matriz de gel. El uso de tubos capilares permite la aplicación de altas tensiones, lo que permite la separación de fragmentos de ADN (y la determinación de la secuencia de ADN) de forma rápida. La agarosa se puede modificar para crear bajo punto de fusión a través de agarosa hidroxietilación. Agarosa de bajo punto de fusión se utiliza generalmente cuando el aislamiento de fragmentos de ADN separados se desea. Hidroxietilación reduce la densidad de empaquetamiento de los haces de agarosa, la reducción efectiva de su tamaño de poro 8. Esto significa que un fragmento de ADN del mismo tamaño se necesitará más tiempo para mover a través de un bajo punto de fusión en gel de agarosa en oposición a un estándar de gel de agarosa. Debido a que los haces de asociarse con un otroa través de interacciones no covalentes 9, es posible volver a fundir un gel de agarosa después de que se ha fijado. EtBr es el reactivo más común usado para teñir ADN en geles de agarosa 10. Cuando se expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromático de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación de energía (luz) como el retorno electrones a estado fundamental. EtBr funciona por sí mismo intercalando en la molécula de ADN de una manera dependiente de la concentración. Esto permite una estimación de la cantidad de ADN en cualquier banda de ADN particular, sobre la base de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de EtBr reduce la tasa de migración del ADN en un 15%. EtBr es un mutágeno y carcinógeno sospechoso, por lo tanto se debe proceder con cuidado al manipular geles de agarosa que lo contienen. Además, EtBr se considera un residuo peligroso y debe ser desechado de manera adecuada. Manchas alternativos para ADN en geles de agarosa son SYBR Gold, SYBR Green, cristal violeta y azul de metilo. De éstos,El azul de metilo y violeta cristal no requieren la exposición del gel a la luz UV para la visualización de las bandas de ADN, reduciendo así la probabilidad de mutación si la recuperación del fragmento de ADN desde el gel se desea. Sin embargo, sus sensibilidades son menores que el de EtBr. SYBR oro y verde SYBR son altamente sensibles, tintes UV dependientes con menor toxicidad que EtBr, pero son considerablemente más caros. Además, todos los tintes alternativos, o bien no puede ser o no funcionan bien cuando se añade directamente al gel, por lo tanto, el gel tendrá que ser teñido posterior después de la electroforesis. Debido a coste, facilidad de uso, y la sensibilidad, EtBr sigue siendo el tinte de elección para muchos investigadores. Sin embargo, en ciertas situaciones, como cuando la eliminación de residuos peligrosos es difícil o cuando los jóvenes estudiantes están realizando un experimento, un medio de contraste menos tóxicas pueden ser preferibles. Tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propósitos principales. Primero se añade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes se mueven a velocidades estándar a través del gel, lo que permite la estimación de la distancia que los fragmentos de ADN han migrado. Los tamaños exactos de los fragmentos de ADN separados puede determinarse trazando el registro del peso molecular de las distintas bandas de un estándar de ADN contra la distancia recorrida por cada banda. El estándar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN desconocidos. Es importante señalar que las diferentes formas de ADN se mueven a través del gel a diferentes velocidades. ADN plásmido superenrollado, debido a su conformación compacta, se mueve a través de la más rápida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal del mismo tamaño, con la forma circular abierta viajar el más lento. En conclusión, desde la adopción de geles de agarosa en la década de 1970 para la separación de ADN, que tienedemostrado ser una de las técnicas más útiles y versátiles en la investigación ciencias biológicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Agarosa que </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido bórico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerígeno-tiene que ser eliminados como residuos peligrosos </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> G-33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xilemae cianol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigador / FX gel sistema de documentación </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Búho Easycast B1 mini gel de electroforesis del sistema </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 de suministro de energía </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

La agarosa electroforesis en gel es la forma más eficaz de separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños que van desde 100 pb a 25 kb 1. La agarosa es aislado a partir de las algas géneros Gelidium y Gracilaria, y consta de agarobiose repetida (L y D-galactosa) subunidades 2. Durante la gelificación, los polímeros de agarosa asociación no covalente y formar una red de paquetes cuyo tamaño de poro determinar un gel de propiedades moleculares de tamizado. El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionado la separación del ADN. Antes de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separó utilizando principalmente de densidad de sacarosa centrifugación en gradiente, que sólo proporcionan una aproximación de tamaño. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de fosfato del ADN (y ARN) molécula está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán a la positively cargo del ánodo. Debido a que el ADN tiene un uniforme relación masa / carga, las moléculas de ADN se separan por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular 3. El modelo principal para el movimiento de ADN a través de un gel de agarosa es &quot;parcial reptación&quot;, con lo que el borde delantero se mueve hacia adelante y tira el resto de la molécula a lo largo de 4. La velocidad de migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por el siguiente: 1) el tamaño de la molécula de ADN, 2) la concentración de agarosa; 3) conformación de ADN 5, 4) la tensión aplicada, 5) presencia de bromuro de etidio, 6) de tipo de tampón de electroforesis en agarosa y 7). Después de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV después de la tinción con un colorante adecuado. Siguiendo este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de: <ol><li> Comprende el mecanismo por el cual los fragmentos de ADN se separan dentro de una matriz de gel </li><li> Comprender cómo la conformación de laMolécula de ADN determinará su movilidad a través de una matriz de gel </li><li> Identificar una solución de agarosa de la concentración adecuada a sus necesidades </li><li> Preparar un gel de agarosa para electroforesis de las muestras de ADN </li><li> La instalación del equipo de electroforesis en gel y la fuente de alimentación </li><li> Seleccionar un voltaje apropiado para la separación de fragmentos de ADN </li><li> Comprende el mecanismo por el cual el bromuro de etidio permite la visualización de las bandas de ADN </li><li> Determinar los tamaños de los fragmentos de ADN separados </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa se describe.

Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

763.5K vistas.  University of California Los Angeles. Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa se describe.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

Seguimiento en tiempo real de la separación de fragmentos de ADN por Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Investigación

Bioquímica

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioingeniería

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

Electroforesis en gel de DNA

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Educación

JoVE Science Education

Biología básica


Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

Separación de proteínas en SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

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Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

Microfluidic Capillary Electrophoresis for Fragment Sizing of PCR Products: A Microchip-Based Electrophoretic Separation Technique to Separate DNA Fragments Based on Size

Source: Wang, H., Zhu et al. <a href="https://www.jove.com/v/59963">A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the microfluidic capillary electrophoresis technique to separate PCR amplicons based on their size. This technique helps in fragment sizing using fluorescent dyes and standard molecular size markers.

Electroforesis capilar microfluídica para el dimensionamiento de fragmentos de productos de PCR: una técnica de separación electroforética basada en microchips para separar fragmentos de ADN en función del tamaño

Source: Wang, H., Zhu et al. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas biológicas

Electrophoresis Techniques

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

Electroforesis de ADN en gel de agarosa

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

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Biología Molecular

Unit 2

Estudiando el ADN y el ARN

TÉRMINOS Y CONCEPTOS CLAVES

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

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Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Prepare two separating gels as described in the text manuscript. Pour the gel between the glass plates using a 1-milliliter pipette, ensuring that the upper 2 centimeters are free of the mixture. Add 70% ethanol on top of the separating gel, creating an even interface between the two layers.
Once the separating gels have polymerized, prepare the stacking gels using instructions in the text manuscript. Then, remove the ethanol from the separating gels, and add the stacking gel solution. Carefully insert a comb with the desired number of pockets, without introducing air bubbles, and allow the gel to polymerize for 20 to 30 minutes.
Load 4 microliters of each sample, as well as the protein ladder, into separate wells. Then, run the gel in Tris-Glycine running buffer at 144 volts for 45 minutes at room temperature. Use pre-warmed Fairbanks solution A to stain the gels on a rocker for 30 minutes, and pre-warmed Fairbanks solution D to decolor the gels on a rocker until the desired background is achieved.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular