PLP es un Investigador Asociado del Centro de Investigación en Salud de Sanford Children. Este trabajo ha sido apoyado por las siguientes subvenciones a PLP: R01AR056712, R01AR052779 y P30 AR061303 del Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de la Salud (NIAMS), MDA y Sanford Children Premio de Investigación en Salud. Este trabajo se ha beneficiado en parte de financiación de la investigación a partir del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en el proyecto FP7-Health - 2009 ENDOSTEM 241440 (activación de las células madre asociadas vasculatura y las células madre de músculo para la reparación y el mantenimiento del tejido muscular) SA fue apoyada por. comunión CIRM.

1. Infección de hESCs Este protocolo requiere alta lentivirus titulación codificación BAF60C y MyoD 13. Estas construcciones están disponibles bajo petición. <ol><li> Recomendaciones antes de comenzar <ol><li> Con el fin de garantizar una alta eficiencia de infección, hESCs placa para la infección en condiciones libres de alimentador (Figura 2A) para eliminar competidores celulares durante la absorción viral. De hecho, MEFs son notoriamente más fácil de infectar el mayor en comparación con hESCs y son competentes para la conversión MyoD mediada. Por lo tanto, la eliminación de los cultivos MEFs células madre aumenta la tasa de infección. </li><li> Se recomienda tener lentivirus alto título para asegurar una alta eficiencia de infección. Opciones para mejorar la eficiencia de la infección se describen en la sección &quot;comprobar la infección&quot;. </li><li> Prepare placas Matrigel recubierto mediante la adición de 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel en cada pocillo y dejar por lo menos 1 hora a temperatura ambiente (o O / N selló a 4 ° Csi se prepara el día anterior). </li></ol></li><li> Procedimiento Infección <ol><li> Día antes de la infección <ol><li> Añadir HES de la célula Clonación y Suplemento de recuperación en el medio a 1000 X de dilución (2 mM de concentración final). </li></ol></li><li> Día 0 - Infección por BAF60C Nota: Realizar la infección de hESCs con BAF60C primero seguido por la infección con MyoD. <ol><li> Disociar un pocillo de una placa de 6 pocillos de hESCs crecido como colonias 14 en una suspensión de células individuales por incubación con 1 ml de TrypLE durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Transferencia de suspensión a un tubo de 15 ml, añadir 9 ml de medio de células madre y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm. </li><li> Durante la centrifugación, preparar la mezcla infección en un tubo limpio mediante la adición de 1 ml de mTeSR1, polibreno (6 mg / ml) y HES de la célula Clonación y Recuperación Suplemento (2 mM). </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular (5 -1 x 10 6 células de aproximadamente 5 x 10 de un confluent bien de hESCs) con 1 ml de la mezcla de la infección y la placa sobre una placa de fijación de 6 pocillos baja, lo que impide que las células se adhieran al plástico. </li><li> Agregar virus BAF60C-IRES-GFP en 10 8 MOI e incubar 3 horas en la incubadora </li><li> Recoger la suspensión celular que contiene los virus y dividir por igual en dos pozos matrigel recubiertos. A continuación, añadir 2 ml de mTeSR1 + hES celular clonado y Recuperación Suplemento a cada pocillo y dejar O / N en la incubadora. </li></ol></li><li> Día 1 <ol><li> Retire con cuidado el medio que contiene el virus y reemplazar con 2 ml de mTeSR1and hES celular clonado y Suplemento de recuperación. Las células se iniciará la formación de grumos como se muestra en la Figura 2B. </li></ol></li><li> Día 2 - Infección por MyoD <ol><li> Antes de continuar compruebe el estado de la fluorescencia de las células bajo un microscopio de fluorescencia para asegurarse de tener una alta eficacia de la infección. Si no es así, consulte la sección &quot;comprobar infectarde iones &quot;. </li><li> Si las células han alcanzado al menos el 80% de confluencia, proceda de la siguiente manera; de lo contrario esperar a que un día adicional antes de continuar. </li><li> Retire el medio y agregar 1 ml de reactivo TrypLE para disociar las células. Incubar 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Repetir como from1.2.2.2 descrito - 1.2.2.6 añadiendo virus MyoD a 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Día 3 <ol><li> Retire con cuidado el medio que contiene el virus y reemplazar con 2 ml de mTeSR1and hES celular clonado y Suplemento de recuperación. </li><li> MEFs Plate sobre matrigel recubren placas a 2,5 x 10 5 / cm 2 para el día siguiente para permitir la propagación de las células infectadas. </li></ol></li><li> Día 4 <ol><li> Retire el medio y agregar 1 ml de reactivo TrypLE para disociar las células. Incubar 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Transferencia de las células en un tubo Falcon de 15 ml, añadir 9 ml de medio de células madre y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm. </li><li> Remove el sobrenadante y volver a suspender en 6 ml de medio de células madre. </li><li> Retire el medio de la placa de 6 pocillos MEFs contienen y hESCs placa a 01:02 relación de división, dispensación 3 ml por cada MEFs contienen también. Sugerencia: Cuando las colonias alcanzan la confluencia, algunos de los pozos de células MyoD/BAF60C-infected se pueden congelar en nitrógeno líquido como existencias de reserva. Medio de congelación incluye el 90% de KOSR y DMSO al 10% más el 2 mM hES celular clonado y Suplemento de recuperación. Los pozos restantes pueden entonces expuestos al protocolo de diferenciación - vea abajo para la descripción. Si se necesitan más células para producir más myospheres, hESCs infectadas se pueden propagar adicionalmente como sigue: </li><li> Se retira el medio y se incuba con 1 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Retire la colagenasa IV y agregar 1 ml de medio de células madre. </li><li> Bajo un microscopio de disección raspan las colonias con una punta de 10 ml. </li><li> Recoge los pedazos de la colonizaciónES en un tubo de 15 ml y permitir sedimentar durante 3 min. A continuación, retire el sobrenadante, resuspender en medio de células madre y la placa sobre placas MEFs utilizando una relación 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Comprobación de la infección <ol><li> Al difundir las células, se recomienda a la placa de las células infectadas en una escala más pequeña de la cosecha para el análisis de ARN y realizar análisis de la expresión de proteínas por inmunofluorescencia para detectar biomarcadores que reflejan la situación biológica correcta en cada fase (ver resultados representativos). Para lentivirus de alto título el porcentaje de células infectadas esperados debe ser al menos 80%. </li><li> Para garantizar una alta eficiencia, los vectores lentivirales se pueden modificar, la introducción de un marcador de selección fluorescente y / o una resistencia a los antibióticos. Nuestra plásmido lentiviral que expresa BAF60C también lleva a la fluorescencia de GFP. </li><li> Clasificación hESCs para un marcador fluorescente. En el caso de la baja eficiencia de la infección se recomienda el uso de la fluorescencia de unacélulas ctivated (FACS-clasificación) para enriquecer las células que expresan virus BAF60C y luego infectar a las células con virus MyoD alto título. <ol><li> Añadir hES celular clonado y Suplemento de recuperación a medio día antes de la clasificación. </li><li> El día de la clasificación, se disocian las células por TrypLE (como se describe en el día 0) y resuspender las células en el suero de reemplazo KO más hES celular Clonación &amp; Recovery Supplement en FACS tubos. </li><li> Al final de la clasificación, recoger las células en el suero de reemplazo KO y placa sobre placas de MEFs la adición de HES de la célula Clonación y Suplemento de recuperación. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-como Inducción y Diferenciación <ol><li> Inducción y diferenciación procedimiento <ol><li> Día 0 - EB inducción <ol><li> Asegúrese de que, antes de iniciar la diferenciación de hESCs BAF60C/Myod-infected, que tienen un alto número de colonias en el pozo (Figura 2C). </li><li> Para cada bien remove el medio, se lavan con PBS y añadir 1 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV. Incubar durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Retire colagenasa y añadir 1 ml de medio de EB. </li><li> Bajo un microscopio de disección rápidamente se disocian mecánicamente las colonias en 400-800 agregados de células raspando con una punta de 10 ml. </li><li> Recoger los trozos de colonias en un tubo de 15 ml y se deja sedimentar durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 3 ml de medio de EB y transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de 6 pocillos bajo apego. </li></ol></li><li> Día 1 <ol><li> Compruebe el tamaño de las colonias y la muerte de las células antes de proceder. Si grandes trozos están presentes, las dividen pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml, 3-4 veces. Si la muerte de las células es muy elevada (muchas células flotantes y escombros) reemplazan el medio mediante la recopilación de los agregados en un tubo de 15 ml por la gravedad y la placa con 3 ml de medio fresco EB, de lo contrario, proceda como sigue. </li><li> Añadir 1,5ml de medio fresco EB en los pozos </li></ol></li><li> Día 2 <ol><li> Cambiar el medio mediante la recopilación de los agregados de los pocillos en un tubo de 15 ml. Deja que se establecen durante 2 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, sustituir con 3 ml de medio fresco EB y redistribuir en los mismos pozos. </li></ol></li><li> Día 3 <ol><li> Añadir 1,5 ml de medio fresco EB en los pozos. </li></ol></li><li> Día 4 <ol><li> Proceda como se describe en el &quot;Día 2&quot;. </li></ol></li><li> Día 5 - diferenciación miogénica de clusters EB-como (Figura 2D). <ol><li> Recoger los agregados como se describe en 2.1.3.1 y lavar una vez con 2 ml de PBS; permiten el agregado de sedimentos. </li><li> Retire PBS y añadir 3 ml de medio MS; Placa en los mismos pozos. </li></ol></li><li> Día 6 - Día 20 <ol><li> De D6 a D20 sustituir el medio con medio fresco cada 3 días. Myospheres representativos se muestran en Figura 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Comprobación de la diferenciación myosphere <ol><li> Antes de continuar, se recomienda comprobar la eficacia de la diferenciación miogénica dentro de los myospheres haciendo secciones de los myospheres incrustados en compuesto OCT, como se describe en el protocolo anterior Jove 12. Realizar una tinción de inmunofluorescencia de marcadores miogénicos como myognenin (F5D clon, DSHB) y de la cadena pesada de miosina (MF20 clon, DSHB) (ver resultados representativos). SUGERENCIA Para tener éxito con la tinción para miogenina en secciones EB es crítico para llevar a cabo la recuperación de antígeno mediante tratamiento con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,5% durante 5 min. Además, es posible utilizar este protocolo para la doble tinción utilizando anticuerpos F5D y MF20. </li></ol></li></ol> 3. Recetas Medios <ol><li> Medio ESC DMEM-F12 1 mM de L-glutamina 20% Knockout Serum medio de sustitución (KOSR) 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA) 50 U / ml de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) 0.1 mM de beta-mercaptoetanol 8 ng del factor de crecimiento / ml de fibroblastos básico (bFGF) </li><li> Medio EB DMEM F12 1 mM de L-glutamina 15% de FBS 5% de suero de caballo </li><li> Medio DM DMEF F12 Suplemento 1X SU Liquid Media 1X N-2 Suplemento </li></ol>

<ol>
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No tenemos nada que revelar.

El protocolo propuesto aquí se describe cómo generar agrupaciones tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres) directamente desde hESCs. La estrategia propuesta tiene el potencial sin precedentes y extraordinaria para producir las mini músculos en suspensión que pueden ser adecuados como una &quot;enfermedad en un plato de&quot; modelo para los ensayos de cribado y estudios de desarrollo. Por otra parte, el método para generar myospheres de hESCs es sencillo y no requiere ningún paso de FACS de clasificación durante la diferenciación, que típicamente tiene un impacto negativo en el rendimiento de células recuperadas. Además, un procedimiento de clasificación durante la diferenciación podría interferir con la agregación, ya que implica una disociación de la JE en células individuales. El método propuesto se basa en la reprogramación epigenética de hESCs con factores específicos, MyoD y BaAF60C, que no se expresan en las células madre embrionarias pluripotentes. MyoD y BAF60C proporcionan el &quot;núcleo&quot; de proteínas th complejoen marcas de los loci genómico a partir de la cual la transcripción procede a activar el programa miogénica esquelético. Los dos factores se entregan a las células por medio de las infecciones de lentivirus y por lo tanto es crítico para obtener una alta eficacia de la infección de ambos factores en todas las células. Esto se puede lograr mediante el uso de virus de alto título o virus dotados de marcadores de selección. Condiciones de cultivo también juegan un papel importante en la optimización de la extensión de la diferenciación miogénica. Proponemos un protocolo de diferenciación basado en suero para la diferenciación de MyoD/BAF60C expresar hESCs en grupos de precursores miogénicas, seguido de incubación en medio definido libre de suero (que contiene transferrina insulina - SU) para lograr la conversión de los precursores miogénicas en miotubos esqueléticos. Sin embargo, es posible que otros medios definidos pueden lograr una diferenciación miogénica igual o mejor. Una limitación actual del protocolo es que se basa en el uso de suero bovino fetal, que, contiene ademásing muchas proteínas y sustancias de origen animal, muestra las variaciones de lote a lote. Esto puede resultar en una menor eficiencia o heterogeneidad de conversión miogénica dentro myospheres. Es de destacar que no todas las estructuras EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs son myospheres; es decir, algunos son agregados EB-como totalmente compuestas de fibras musculares. El número de myospheres normalmente derivadas de hESCs que expresan BAF60C y MyoD puede variar de 30 a 60% según lo estimado mediante inmunotinción sobre secciones EB realizó al final del protocolo (ver resultados). Un enfoque potencial para enriquecer a una placa de cultivo sólo myospheres sería el uso de un reportero miogénico. Esto facilitaría descartando los grupos EB-como diferenciados parcialmente o no, y seleccionar sólo los myospheres. Por último, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a los requisitos temporales de los factores introducidos sería útil para mejorar el método de entrega. Por ejemplo, si BAF60C y MyoD se requieren sólo para SHtiempo ort &quot;patear&quot; las células en la dirección correcta, se podría aplicar métodos basados ​​en la entrega ARNm modificado. Por el contrario, si se necesitan los factores para un tiempo más largo antes de que las células explotan sus proteínas endógenas, un enfoque episomal se recomienda para eliminar la variabilidad y efectos incontrolados debido a la integración en el genoma. Finalmente, observamos que es obligatorio para expresar BAF60C antes o al mismo tiempo como MyoD (nunca después) con el fin de lograr la conversión células madre en los músculos esqueléticos. El requisito previo para la expresión de BAF60C presumiblemente se basa en su papel en el pre-establecer el paisaje epigenético para la distribución adecuada de la cromatina a través de la MyoD genoma 6,15. Como tal, los futuros protocolos podrían mejorarse por compuestos u otras manipulaciones que estimulan la expresión BAF60C en hESCs.

Debido a su capacidad única de auto-renovación, manteniendo la pluripotencia, las células madre embrionarias humanas (hESCs) se consideran un recurso muy valioso en la medicina regenerativa. Generación de células madre de repoblación mediada de músculos enfermos y células hESC-o madre pluripotentes inducidas (IPSC) derivada de los músculos esqueléticos para el modelado de la enfermedad in vitro son objetivos principales de los estudios dirigidos a la identificación de tratamientos y elucidar la patogénesis de muchas enfermedades neuromusculares. Sin embargo, estos estudios han sido cuestionados por la resistencia de hESCs para convertir a las células musculares esqueléticas y por la escasez de información sobre la regulación molecular de células madre-compromiso hacia miogenia esquelético. De hecho, los intentos previos para generar células progenitoras de músculo esquelético de hESCs revelaron que sólo el cuerpo embrioide progenie (EB) o derivados de células mesenquimales son competentes para activar miogenia esquelético siguiente expresión ectópica de activadores de la transcripción (por ejemplo,Pax3 o Myf5) 1-3 o por la exposición a condiciones de cultivo específicas 4-5. Hemos demostrado anteriormente que el componente SWI / SNF, BAF60C (codificada por SMARCD3), es un componente esencial de la maquinaria transcripcional que permite la activación MyoD mediada de loci muscular específica 6. Recientemente hemos descubierto que la ausencia selectiva de BAF60C confiere a hESCs la resistencia a la activación mediada por MyoD de la miogénesis esquelético 7 que se observa lo contrario en BAF60C expresando células somáticas 8-10, un proceso comúnmente referido como conversión miogénica. La expresión forzada de BAF60C permite MyoD para activar directamente miogenia esquelético en hESCs, de las condiciones específicas de cultivo, con BAF60C y MyoD imponer una firma epigenética que compromete hESCs hacia el linaje miogénico 7. Es de destacar que el análisis proteómico anterior reveló la ausencia selectiva de BAF60C, entre los componentes de SWI / SNF, en los CES 11. Se utilizó este conocimiento para imponer un compromiso epigenética de hESCs en el linaje miogénico, que conduce a la generación de una población homogénea de mioblastos esqueléticos que podrían ser agregados para formar contráctil tridimensional estructuras (myospheres) que los músculos esqueléticos miniaturizados funcionalmente imitan 7. De hecho, nuestro método de generación de los progenitores del músculo esquelético de hESCs depende del compromiso epigenética de hESCs al linaje miogénico, que es fenotípicamente latente hasta que las células están expuestas a las señales de diferenciación, tales como células la agregación y la cultura en medio de diferenciación (ver protocolo específico). Esta estrategia permite la expansión de una población homogénea de hESCs que se epigenéticamente comprometida con el linaje del músculo esquelético y adecuado para la formación de myospheres contráctiles tridimensionales que recapitular histológico y propiedades funcionales de esqueléticomúsculos. Los myospheres proporcionan la primera evidencia de los músculos miniaturizados explotables para una &quot;enfermedad en un plato de&quot; modelo de las enfermedades musculares. Cuando generada a partir de derivados de pacientes CMPI, estos myospheres tienen el potencial para dilucidar preguntas de desarrollo de muchos años y la patogénesis de enfermedades raras, además de ofrecer el tremendo potencial como herramienta de cribado de alto rendimiento de compuestos terapéuticos. También tomamos nota de que una lectura inmediata de myosphere análisis podría ser proporcionada por inmunohistoquímica en secciones, como se describe en el protocolo JoVE por Gomes et al. 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Generación de una población homogénea y abundante de células del músculo esquelético a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) es un requisito para las terapias basadas en células y por una &quot;enfermedad en un plato de&quot; modelo de las enfermedades neuromusculares humanos. Obstáculos importantes, como la baja abundancia y heterogeneidad de la población de interés, así como la falta de protocolos para la formación de estructuras contráctiles tridimensionales, han limitado las aplicaciones de las células madre para trastornos neuromusculares. Hemos diseñado un protocolo que supera estos límites por introducción ectópica de factores definidos en hESCs - el factor de MyoD determinación muscular y SWI / SNF remodelación de la cromatina BAF60C componente complejo - que son capaces de reprogramar hESCs en las células del músculo esquelético. A continuación se describe el protocolo establecido para generar mioblastos hESC-derivados y promover su agrupación en estructuras miniaturizadas tridimensionales (myospheres) que imitan funcionalmente músculos esqueléticos miniaturizados 7 </sup&gt;.

Figura 1A muestra un esquema del protocolo propuesto para generar myospheres de hESCs. Los pasos críticos con el control (indicadas por las flechas) son la eficiencia de la infección en hESCs y la conversión miogénica dentro de los myospheres. En nuestros experimentos nos aprovechamos de un vector lentiviral que codifica BAF60C que lleva la fluorescencia de GFP. Nos suele infectar a las células con BAF60C y FACS-tipo 72 horas después de la infección para enriquecer a la población expresar BAF60C. Cuando las células alcanzan alrededor de un 70-80% de confluencia, se infectan con lentivirus MyoD. Después de la primera infección que se necesita normalmente dos o tres días para las células para alcanzar esa confluencia. La Figura 1B muestra los niveles de expresión de los genes exógenos como veces de inducción con respecto a hESCs no infectadas. Figura 1C muestra la expresión y distribución a nivel de proteínas de los factores introducidos. BAF60C<html> expresión se muestra como la fluorescencia de GFP, mientras que la expresión de MyoD se detecta por inmunofluorescencia con un anticuerpo MyoD. Consideramos Día 0 el día que empezamos la diferenciación de hESCs infectados en agregados EB-como. Después de 15 días en medio DM, una parte de los myospheres (generalmente un todo bien) está incrustado en compuesto OCT 12 y seccionada para llevar a cabo inmunofluorescencia para marcadores miogénicas para comprobar la eficiencia de conversión miogénica. Figura 1D muestra la tinción representativa para miogenina y la miosina de cadena pesada en una diferenciación miogénica óptima. Myospheres pueden tener diferentes formas o inusuales, tal vez como resultado de la fusión con myospheres más pequeñas. A partir del día 10, es posible observar la contracción esporádica en los myospheres (ver la película 1 y 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. A) Esquema del protocolo utilizado para la generación de myospheres de hESCs. B) los niveles de mRNA de los genes exógenos en hESCs infectadas con BAF60C y MyoD (H9-BM) supervisado por QRT-PCR y se expresó como veces de inducción, como se en comparación con burlarse hESCs infectados imágenes (H9-CTR). C) que muestran tinción de inmunofluorescencia MyoD (rojo) y fluorescencia BAF60C (verde) debido al elemento IRES-GFP en el vector. D) Inmunofluorescencia realiza en myosphere secciones teñidas para Miogenina (MYOG ), la cadena de miosina pesada (MyHC) y counterstained para DAPI (véanse los detalles de inmunofluorescencia). La barra de escala es de 100 micras. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes representativos de la apariencia de células en diferentes etapas de laprotocolo de la infección (parte I) a la diferenciación (parte II). Barra de escala es de 100 micras. Considerando que las estructuras EB-como D1 a D5 son en su mayoría de forma circular (D), myospheres cultivadas durante 15 días según el esquema de la figura 1A presenta una forma impredecible y son heterogéneos en cultivo; ver dos ejemplos en E y F.

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Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K vistas.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos. 

Video: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
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Investigación

Biología

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.