Este trabajo fue apoyado por fondos de RAW de las siguientes opciones: Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01 DK083512, DP2 OD008470, y R01 DK100237; March of Dimes Basilio O&#39;Connor arranque Académico concesión de una subvención # 5 FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame College de Ciencia y el Departamento de Ciencias Biológicas; y un regalo generoso de la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su dedicación excepcional en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista sobre este trabajo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito los métodos que permiten la visualización de los componentes del segmento de nefronas en el pez cebra adulto. La inyección de conjugados de dextrano fluorescentes permite etiquetado PCT preferencial debido a las propiedades endocíticas de estas células del túbulo proximal 30,38. Este método se puede realizar con gran flexibilidad debido a la existencia de dextranos que se puede obtener con un grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Además, el uso de dextranos-lisina fijable es una forma especialmente conveniente para etiquetar PCT segmentos, ya que no se requieren procedimientos de etiquetado secundarias. Esto permite la detección de señal relativamente sencillo y es compatible con muchos otros marcadores fluorescentes, immunolabeling, y el uso de líneas transgénicas reportero. Etiquetado de fosfatasa alcalina también marca el túbulo proximal, con una fuerte reactividad en el PCT y reactividad ligeramente más débil en el PST. Finalmente, la tinción DBA permite el etiquetado de los segmentos tubulares distales, que muestran un characteristic ramificado morfología. Varias moléculas de lectina, que son proteínas de unión a azúcar de origen no inmune, se han utilizado ampliamente para distinguir segmentos de nefrones de mamíferos 47. Es interesante que DBA en el pez cebra se correlaciona con segmentos del túbulo distal, ya que se utiliza para marcar los conductos colectores en los riñones de mamíferos 47. Tomados en conjunto, estos métodos pueden ser utilizados en diversas combinaciones para documentar la composición y la función renal. Puesto que todos estos métodos se pueden utilizar en las preparaciones de riñón enteros, proporcionan herramientas para evaluar la estructura y la función de nefronas en todo el órgano, sin depender enteramente en el uso de más tiempo, los métodos tediosos, por ejemplo, el trabajo cryosection y immunolabeling. Sin embargo, las manchas descritas en este artículo son métodos viables en sección criogénica. Análisis criosección genera muestras (en comparación con todo el montaje) que son más adecuados para la inmunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, aunque, por supuesto, este tipo de análisis requiere la disponibilidad de anticuerpos primarios adecuados. Lamentablemente, uno de las principales limitaciones en el trabajo con el modelo animal pez cebra sigue siendo la escasa disponibilidad de anticuerpos. Así DESEO sigue siendo el más utilizado, es decir, &#39;go-to &quot;, procedimiento para el análisis de la expresión génica. DESEO utilizando reacciones de sustrato BCIP, NBT, y / o INT para producir precipitados morados o rojos no es compatible con la tinción fluorescente en cryosections. Una opción sería para invocar el uso de la detección de WISH fluorescente, un procedimiento que ha sido optimizado para muestras de embriones de pez cebra y podría ser adaptado para su uso con el riñón adulto. La descripción de los métodos en este artículo de vídeo debería permitir una mayor experimentación con técnicas como DESEOS fluorescente en combinación con las líneas de pez cebra transgénico en el que los segmentos individuales están etiquetados con un reportero como eGFP o mCherry. Alternativamente, los métodos descritos aquí COULd ser probado en combinación con otros colorantes vitales, por ejemplo, otras lectinas. De esta manera, una mayor adaptación y ampliación de los métodos descritos aquí se pueden invocar para satisfacer las necesidades del investigador para preparaciones enteras renales montaje y análisis. Como tales, estos métodos tienen un amplio potencial para la aplicación con el modelo de pez cebra para los estudios de regeneración en curso y también en el modelado de la enfermedad genética. Hay una necesidad apremiante para la investigación y los tratamientos innovadores para las aflicciones renales. Millones de personas sufren de algún tipo de enfermedad renal cada año que resulta de causas congénitas, agudos y / o crónicos. Además, la prevalencia de la enfermedad renal sigue aumentando en todo el mundo, por lo que estas enfermedades un problema de salud pública mundial 14,15. Tratamientos como la hemodiálisis están disponibles mediante el cual una máquina de diálisis externa sirve para extraer la sangre de los desechos metabólicos del paciente si sus riñones no son capaces de realizar este papel. Desafortunadamente, Esta intervención tiene limitaciones, como el tratamiento continuo es necesario para la supervivencia. Por otra parte, los pacientes necesitaran un trasplante de riñón, que puede tomar años para recibir una vez que un paciente se coloca en una lista de espera. Incluso después de la obtención de un trasplante de riñón, muchos pacientes sufren efectos adversos como resultado del procedimiento y deben luchar contra estos efectos para el resto de sus vidas. Estas dificultades ponen de manifiesto la necesidad seria para el desarrollo de nuevos tratamientos para ayudar a prevenir ya sea enfermedad del riñón o tal vez para aumentar la regeneración de tejidos 8,16,52,53. Dadas las limitaciones éticas evidentes del uso de sujetos de prueba humanos en laboratorios biomédicos, los modelos animales son esenciales para el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana y para la prueba de nuevos tratamientos. Como resultado de su similitud y proximidad anatómica evolutiva, el ratón se ha convertido en el modelo más ampliamente utilizado de la enfermedad humana 45. Sin embargo, hay ciertas limitaciones con este animal, incluído,ing incapacidad para visualizar el desarrollo de órganos in vivo y la practicidad de completar pantallas genéticos a gran escala. El pez cebra es un organismo relevante y útil modelo para el estudio del desarrollo de órganos y el modelado de la enfermedad humana 45,46. En lo que respecta a las enfermedades humanas, existen homólogos funcionales en el pez cebra para casi el 70% de todos los genes humanos 54,55. Trabajos recientes han puesto de manifiesto la utilidad de pez cebra para muchas áreas de la investigación renal 31,37,56. Los estudios de regeneración y reparación en el pez cebra después de AKI sugieren que la regeneración del epitelio del túbulo y neonephrogenesis son dos procesos que se producen y se superponen a lo largo de la regeneración timecourse 30,37. El uso de un llamado gentamicina antibiótico aminoglucósido se ha utilizado como un paradigma de lesión a través del cual para estudiar los resultados de AKI en 29,30,37 adultos de pez cebra. Durante un período de dos semanas después de una lesión de aproximadamente de gentamicina, el Tubul proximales regeneran, y mientras tanto nuevas nefronas se forman a lo largo del órgano 29,30,37. En general, los mecanismos que regulan la regeneración epitelial siguen siendo muy controvertidos. En un mecanismo propuesto del proceso de reparación, no es el evento inicial de lesión aguda seguida de un desprendimiento de las células muertas en el lumen. A continuación, hay una serie de de-diferenciación, proliferación, y eventos de migración, después de lo cual las nuevas células se diferencian, repoblación de la membrana basal heridos y restaurar la función a la zona lesionada. Por otra parte, otros estudios han sugerido que las células de reemplazo se derivan de células madre / progenitoras que residen dentro de los túbulos nefrona. En cuanto al proceso de neonephrogenesis en el pez cebra, los agregados celulares se han observado siguiente AKI por inyección de gentamicina 29,30. Estos agregados posteriormente maduran hasta convertirse en nuevas nefronas que sondean en los túbulos ya existentes 29,30. El hilo común que une nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis es su factor de misterio enorme: en la actualidad no son exponencialmente más preguntas acerca de cómo se producen estas hazañas regenerativas que existen puntos de vista disponibles. Hasta la fecha, sin embargo, varias líneas interesantes de evidencia apoyan la noción de que la investigación de regeneración renal utilizando el pez cebra puede de hecho brindar conocimientos comparativos pertinentes en AKI humano que también puede tener directa traslacional potencial 56-58. Química de detección para identificar pequeñas moléculas que aumentan la proliferación de células progenitoras renales en el embrión de pez cebra recientemente llevado a la identificación de la -butanoato inhibidor de histona desacetilasa metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La administración de este compuesto para las larvas de pez cebra con inducida por gentamicina-AKI reveló que la supervivencia larval aumenta y que la proliferación tubular renal se mejoró 56,58. Cuando los ratones con lesión renal aguda inducida por isquemia moderada fueron tratados con m4PTB, su recuperación se aceleró en asociation con una reducción tanto en la atrofia y el ciclo celular tubular detención de la proliferación de las células tubulares renales 58. Estos hallazgos sugieren que las vías responsables para el desarrollo normal del pez cebra renal y / o la respuesta regenerativa a AKI se conservarán con los mamíferos 56. Así, mientras que se necesitan más estudios para desmenuzar los mecanismos de regeneración-es decir, para identificar las vías de señalización que intervienen y comprender su interacción-el pez cebra proporciona una vía prometedora para perseguir esta meta importante en el campo de la nefrología. Herramientas tales como las etiquetas de células nefrona descritos en este protocolo representan un grupo de ensayos que pueden ser utilizados para evaluar la composición y la funcionalidad renal en modelos AKI. Además, se pueden aplicar para caracterizar modelos transgénicos de la enfermedad renal y pueden proporcionar maneras de identificar agentes terapéuticos químicos capaces de promover la restauración de la estructura después de la presa nefrona renalla edad.

El riñón es un órgano complejo que cumple con una multitud de funciones fisiológicas en el cuerpo. La función principal del riñón es la excreción de desechos metabólicos, y esta tarea está estrechamente entrelazada con el mantenimiento de la homeostasis de fluidos. El riñón realiza estos trabajos mediante el filtrado de la sangre y la formación de la orina, mientras que concomitantemente regulación de la presión arterial, los niveles de electrolitos y el equilibrio ácido-base. Túbulos epiteliales altamente especializadas, llamadas nefronas sirven como unidad funcional básica del riñón 1,2. En los vertebrados adultos, nefronas se organizan típicamente en una disposición en espiral que rodea herméticamente un sistema de drenaje centralizada, permitiendo así que para muchos túbulos tapen la bastante pequeño órgano. Por ejemplo, cada riñón humano puede contener más de 1 millón de nefronas 3. Otros mamíferos como el ratón son en el orden de 8 a 10.000 nefronas por riñón 4. El grado de complejidad renal difiere entre estos mamíferos y otros vertbrados debido a las variaciones en el número total de nefronas y su diseño arquitectónico dentro del riñón. Especies de vertebrados forman hasta tres estructuras renales sucesivas durante el desarrollo, y cada formulario muestra el aumento de la complejidad en lo que respecta a la dotación de nefronas y disposición: los pronefros, mesonefros y metanefros. La última estructura renal que deben conservarse sirve como el riñón adulto órgano-típicamente un mesonefros o un metanefros 2. Cada forma de riñón, sin embargo, tiene una composición basada en nefrona 2. La nefrona es el caballo de batalla de los riñones y es responsable de la filtración de la sangre junto con la secreción y reabsorción de metabolitos. Las nefronas son estructuras tubulares simples compuestas de células epiteliales y tienen una organización segmentaria, en el que los dominios discretos, altamente especializadas de los epitelios diferenciados realizar tareas específicas. En el orden del flujo de filtrado a través de las nefronas, normalmente hay tres partes principales que comprise cada unidad: (1) el corpúsculo renal, (2) un túbulo con proximal, intermedio y segmentos distales, y (3) un conducto colector 1. El túbulo proximal es responsable de la reabsorción de solutos orgánicos, principalmente glucosa y los aminoácidos 1. El túbulo intermedio (o asa de Henle) es un importante sitio de la sal y el agua la regla 1. Finalmente, ajuste fino de la sal y otros iones produce en el túbulo distal y el conducto colector y está muy regulada por el sistema endocrino 1. A partir de ahí, el filtrado viaja a través del uréter y de la vejiga, en última instancia, saliendo el cuerpo como un producto de desecho 1. La pérdida de la función renal puede deberse a multitud de causas que impiden la actividad normal de nefronas. Estas causas pueden ocurrir durante el desarrollo del riñón, por ejemplo, defectos congénitos que llevan a la malformación de nefronas 5 o causas de los diferentes tipos de lesiones (derivada de tanto genéticos como environmeorígenes NTAL). Lesiones adquiridas son una categoría como la lesión renal aguda (IRA) o insuficiencia renal crónica (ERC). AKI implica una pérdida abrupta de la función renal, a menudo como resultado de la isquemia o la toxina de exposición 6,7. En los mamíferos, la reparación del epitelio nefrona es posible después de este tipo de lesiones 8, y muchas personas presentan la restauración completa de la función renal después de AKI. Sin embargo, AKI también se asocia con una alta morbilidad y mortalidad que se han reportado en un amplio 30 - rango de incidencia del 70% 6,7. ERC, en cambio, está asociada con la pérdida progresiva de la función renal que resulta de años de daño prolongado, típicamente asociado con la fibrosis 8,9. Además, existe una interacción entre la IRA y ERC, como cualquiera puede predisponer a un individuo a otro 10-12. Por ejemplo, aquellos que han sufrido de AKI son más susceptibles a la enfermedad renal crónica e incluso la muerte 13. La incidencia de la enfermedad renal, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo, ha alcanzado epideproporciones de micrófono y se prevé que aumentará a medida que la población de edad se amplía-por lo tanto hay una necesidad creciente de identificar intervenciones de medicina regenerativa para el riñón 14,15. A pesar del conocimiento de que los pacientes con LRA pueden recuperar, por mucho tiempo se ha pensado que el riñón es un órgano sin poderes regenerativos innatas. Esta visión tradicional ha sido revisado de manera espectacular en los últimos años 16. Los estudios que investigan el daño renal en ratones y ratas después de la IRA han demostrado que las células epiteliales de los túbulos nefrona pueden proliferar y reconstruir nefronas funcionales 17-20. Aunque los mamíferos poseen esta capacidad de adaptación para regenerar nefronas, existen limitaciones notables y las respuestas de mala adaptación puede ser desencadenados que conducen a la fibrosis renal y ERC 21. Por ejemplo, un estudio reciente demostró que la ablación repetida de células epiteliales en nefronas murinos se asoció con la regeneración disminuida y fibrosis nefronas renales HAV-sugiriendoea limita umbral de regeneración 22. No hay evidencia de que el riñón de mamíferos adultos forma nuevas nefronas para reemplazar los perdidos o dañados, por lo tanto su destrucción conduce a un déficit de 8,9 nefrona permanente. Curiosamente, algunos vertebrados responden a AKI por la regeneración de los epitelios de nefronas y también la producción de nuevas nefronas, un proceso conocido como neonephrogenesis o nefrona neogénesis 23. Neonephrogenesis ocurre en los peces después de la exposición a tóxicos o resección parcial y modelos de lesión históricamente han incluido los peces de colores 24,25, tilapia 26, patín 27, medaka 28, y más recientemente, el pez cebra 29,30. De éstos, el pez cebra proporcionar un modelo de investigación genética viable para descubrir las vías celulares y moleculares responsables de la regeneración renal. En este artículo de vídeo, nos demuestran cómo etiquetar los segmentos de la nefrona en el pez cebra adulto. El conocimiento de la anatomía de nefronas, las características moleculares,y las características funcionales son esenciales para los estudios renales futuros exitosos utilizando el pez cebra. El riñón adultos de pez cebra es una estructura mesonefros y es inherentemente menos complejo en cuanto a número de nefronas y organización de la estructura metanefros se encuentra en los mamíferos adultos, aves y reptiles 31. Sin embargo, la organización del segmento de nefronas pez cebra es análogo a los mamíferos, y se documentó por primera vez en el riñón de embriones en base a estudios de expresión génica 31-35. Nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos lineales tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo proximal recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL) 31-35 (Figura 1). Nefronas adultos de pez cebra poseen segmentos tubulares similares 30,31,36,37 (Figura 1). El PCT también se puede identificar por un fenotipo funcional: las células epiteliales en la PCT incorporarán compuestos de dextrano marcados con fluorescencia (10-70 kDa en tamaño) presentes en elcirculación, que se ha utilizado tanto en el pez cebra riñón embrionarias y adultas para evaluar la captación endocítica por estas células del túbulo proximal 38-41 (Figura 1). Una de las diferencias en los segmentos de la nefrona entre el pez cebra y mamíferos es que el pez cebra carecen de un túbulo intermedio o asa de Henle 30-37; ya que este segmento funciones en los mamíferos para conservar el agua, y el pez cebra son una especie de agua dulce, sin la urgencia de concentrar la orina, no es de extrañar que el pez cebra carecen de este segmento de 32,33. Así, la composición global nefrona se conserva en gran medida entre el pez cebra y el riñón de los mamíferos 32,33. Estas similitudes han permitido pez cebra a ser una herramienta de investigación eficaz para investigar las funciones de los genes renales-expresado durante nefrogénesis desarrollo 32-35,42 y modelar numerosas enfermedades renales 43,44, lo que añade a la lista sustancial de las condiciones humanas que pueden ser investigado utilizandopez cebra 45,46. Hoy en día, el riñón adultos de pez cebra es un modelo atractivo para los estudios comparativos de la regeneración renal debido a su maleabilidad genética y el paladar expansión de los recursos tecnológicos disponibles para interrogar a la función de genes y vías de señalización en esta especie. Varios estudios han utilizado el mesonefros pez cebra para investigar los mecanismos de regeneración después de AKI 29,30,37. Para continuar la investigación AKI usando el riñón adultos de pez cebra, es esencial disponer de métodos exquisitos para etiquetar las diferentes regiones y métodos nefrona para estudiar la funcionalidad de nefronas. Existen varios métodos para el análisis de riñón adulto han sido adaptados de los protocolos de riñón embrionario. La inyección intraperitoneal de dextrano marcado con fluorescencia en el pez cebra adultos etiqueta el epitelio PCT en mesonefros nefronas a través de endocitosis 30, como en embriones de pez cebra 38-41 (Figura 1). Este método ha sido utilizado para visualize cuando los túbulos proximales a recuperar su propiedad reabsorbiendo siguiente AKI, que permite una evaluación de la función fisiológica restaurado 30 (Figura 1). Otra característica de la nefrona túbulo proximal es que las células epiteliales en este segmento poseen un borde en cepillo 37 que muestra altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Por lo tanto, el epitelio proximal puede ser localizada visualmente en el riñón pez cebra adultos usando una técnica basada en la fluorescencia conocido como elfo (marcado con enzima-Fluorescencia) -97 47. Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos de absorción de dextrano fluorescentes 30,48 en el riñón adultos de pez cebra, a fin de obtener una evaluación funcional del túbulo proximal y mapear el tamaño y los contornos de este segmento tubular. A continuación, se describen las técnicas para etiquetar las regiones del túbulo proximal de la nefrona adulto con la etiqueta fluorescente fosfatasa alcalina. En tercer lugar, se muestra por primera vez que el rodioamina marcada con lectina aglutinina Dolichos biflorus (DBA), que se ha utilizado como un marcador general de los conductos colectores en el riñón de los mamíferos 49, marca los túbulos distales del riñón adultos de pez cebra. Como DBA es mutuamente exclusivo a la tinción de fosfatasa alcalina, estas etiquetas proporcionan una manera de distinguir ampliamente pan-proximal frente tramos pan-distales de la nefrona adultos de pez cebra. A lo largo de la ejecución de estas manchas fluorescentes en toda ambas montura y secciones histológicas de criostato, relacionamos estas etiquetas con dominios de expresión de genes transportadores de soluto que identifican de forma única cada segmento de la nefrona. Por lo tanto, este protocolo también contiene una guía de los procedimientos de procesamiento de tejidos modificados para tejido adulto todo el montaje hibridación in situ (DESEO) el análisis basado en el protocolo DESEO embrión 50. Estos procedimientos se pueden utilizar en diversas combinaciones (Figura 2) para documentar atributos morfológicos y funcionales of adultos nefronas renales pez cebra. Por lo tanto, estos protocolos se pueden aplicar a estudios de regeneración, la caracterización fenotípica de otros modelos de enfermedades renales, e incluso utilizarse para estudiar la formación del riñón adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

El modelo de pez cebra se ha convertido en un sistema relevante para estudiar el desarrollo del riñón, la regeneración y la enfermedad. Tanto los riñones de pez cebra embrionarias y adultas se componen de unidades funcionales conocidas como nefronas, que son altamente conservadas con otros vertebrados, incluyendo mamíferos. Investigación en el pez cebra se ha demostrado recientemente que los dos fenómenos distintivos transpiran después de nefronas adultos incurren en daños: en primer lugar, hay una regeneración robusta dentro de las nefronas existentes que reemplaza las células epiteliales del túbulo destruidas; segundo, totalmente nuevas nefronas se producen a partir de progenitores renales en un proceso conocido como neonephrogenesis. En contraste, los seres humanos y otros mamíferos parecen tener sólo una capacidad limitada para la regeneración epitelial nefrona. Hasta la fecha, los mecanismos responsables de estos fenómenos de regeneración renal siguen siendo poco conocidos. Desde riñones pez cebra adultos sufren tanto nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis, proporcionan un párrafo experimental excepcionalparadigma para estudiar estos eventos. Además, existe una amplia gama de herramientas genéticas y farmacológicas disponibles en el modelo de pez cebra que se pueden utilizar para delinear los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regeneración renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe un conjunto de técnicas de etiquetado que se pueden utilizar para medir la composición y la funcionalidad renal nefrona prueba en el riñón adultos de pez cebra. Por lo tanto, estos métodos son ampliamente aplicables para el futuro caracterización fenotípica de los paradigmas de pez cebra adultos lesión renal, que incluyen pero no se limitan a, los regímenes de exposición nephrotoxicant o métodos genéticos de la muerte celular específica, tales como la técnica de ablación celular mediada por nitrorreductasa. Además, estos métodos pueden ser utilizados para estudiar la formación de perturbaciones genéticas en riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de la enfermedad crónica.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K vistas.  University of Notre Dame.  El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Extracción de sangre para análisis bioquímicos en adultos de pez cebra

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

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