T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. gene targeting Diseño <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ordene un clon BAC apropiado que cubre la región genómica de interés. Asegúrese de que este es isogénica con el tipo de células madre embrionarias que ser modificado, por ejemplo, los clones RPCI-23 y RPCI-24 BAC para la orientación de genes con C57BL / 6 ES células. </li><li> Aplicar gen convencional criterios de orientación en el diseño de los ataques de vectores. Los parámetros clave incluyen si se requiere la modificación a ser constitutivo o condicional, definiendo exones críticos (CE) para la supresión en una estrategia gen knockout y el espaciamiento y la colocación de cintas intrónicos. NOTA: Cada uno de ellos ha sido discutido en detalle en otra parte 10. </li><li> Elija regiones genómicas cada uno de 5-6 kb que flanquean el sitio de modificación de destino. NOTA: Por consiguiente, el tamaño del inserto subclonado es típicamente 10-12 kb, aunque el límite superior puede ser tan alto como 80 kb con un bajo número de copias del plásmido como subclonación p15A, etc. pBR322 y hasta 200 kb con un BACvector. </li></ol> 2. Multiplex recombinería Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oligos de diseño para el esqueleto del plásmido (plásmido subclonación) y el marcador seleccionable (casete de inserción). Diseñar cada oligo tal que contiene 180 pb HA que flanquea el sitio diana genómico y 20 pb de la secuencia de cebado específico de la casete de inserción o el plásmido subclonación (Figura 2). NOTA: brazos de homología no deben contener elementos repetitivos, la presencia de elementos repetitivos se traducirá en la orientación incorrecta y subclonación. Elementos repetitivos pueden ser detectados mediante el uso de herramientas basadas en la web, como el &#39;&#39; Repite Enmascarador &#39;&#39;. </li><li> Incluir un sitio único de enzima de restricción (RE) sobre uno de los oligos de vectores para linealizar el vector genes de la orientación para la orientación de células ES (Figura 2). </li><li> Compruebe los parámetros oligo utilizando un programa analizador de oligo. Tenga cuidado de evitar estructuras secundarias en la región de cebados. </li><li> Shorter HA (50 pb) del casete de inserción es tolerada y produce menor número de recombinantes, pero asegúrese de que el plásmido subcloning HA es siempre más larga (180 pb). </li><li> Determinar la orientación del inserto de ADN genómico de lo particular clon BAC utilizando herramientas basadas en web como &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Establecer la dirección de replicación del oriS comprobando el mapa de la columna vertebral plásmido BAC utilizados en la construcción de la biblioteca BAC. NOTA: oris es generalmente opuesta a la dirección de la transcripción del marcador de cloranfenicol (CHL) para todos los plásmidos BAC utilizados comúnmente. </li><li> Añadir dos enlaces terminales de fosforotioato (PTO) al extremo 5 &#39;del oligo que es opuesta a la dirección de la replicación en el clon BAC. Añadir una modificación 5 &#39;fosfato a la oligo inverso (Figura 2). NOTA: La asimétrica phosphorothioated casete PCR tras la digestión Red genera un ssDNA intermedio que puede cebar la cadena retrasadadel tenedor de replicación. NOTA: Maximal multiplex frecuencia de recombinación se observa con los cassettes protegidas filamento de revestimiento. Principal capítulo protegida o casetes protegidas duales no puede producir eficiencias de recombinación equivalentes en una loci. </li><li> Ordene oligos con la página o la purificación HPLC. </li></ol> 3. Transformación BAC clon con pSC101 BADgbaA recombinería plásmido. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para hacer que la E. coli cepa que lleva el recombinería BAC competentes, transformada con el plásmido pSC101 BADgbaA que contiene los genes rojos 16. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA contiene los genes rojos y RecA bajo el control de la inducible araC-P BAD promotor de arabinosa, un marcador de selección de tetraciclina y el replicón pSC101 sensible a la temperatura. <ol><li> Apuñalar a una punta de pipeta estéril en el cultivo de agar BAC e inocular 5,0 ml de caldo lisogenia (LB) pH 8,0 que contenía 12,556; g ml -1 Chl. Crece a 37 ° C durante 5 horas con agitación a 200 rpm. </li><li> Chill 10% (v / v) de solución de glicerol, tubos de microcentrífuga y cubetas de electroporación sobre hielo. Enfriar una gran centrifugadora y microcentrífuga refrigerada a 4 ° C. </li><li> Determinar la densidad óptica (DO) del cultivo usando un espectrofotómetro y medir la absorbancia a 600 nm. Preparar células electrocompetentes (como se describe a continuación) cuando se alcanza una lectura OD 600 de 0,3 a 0,8. </li><li> Centrifugar las células en un tubo de centrífuga de 50 ml en un gran centrifugar a 1216 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 1 ml de frío 10% de glicerol y centrifugar las células a 17.949 xg durante 20 segundos a 4 ° C. Realice el lavado de paso un total de 3 veces. </li><li> Resuspender las células en un volumen total de 50 l de 10% de glicerol y añadir 10-200 ng del plásmido pSC101 recombineering BADgbaA. Obtener una única suspensión celular mediante pipeteoarriba y abajo varias veces y luego transferir las células a un pre-refrigerada 1 mm cubeta de electroporación de brecha. </li><li> Electroporar las células con un ajuste de 1,8 kv, 25 mF y 200 Ω. NOTA: Compruebe los ajustes correctos para cada marca de electroporador. Una constante de tiempo de la electroporación menos de 4 indica la presencia de sal y otras impurezas. </li><li> Inmediatamente recuperar las células en 1 ml de LB y transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Mantener el cultivo GBAA BAC a 30 ° C durante 2 horas con agitación a 200 rpm. NOTA: El plásmido pSC101 BADgbaA se pierde cuando las células se cultivaron a 37 ° C debido a la inactivación del factor de replicación sensible a la temperatura repe. Se cultivan las células GBAA a 30 ° C para mantener las funciones recombinería. </li><li> Añadir 9 ml de LB que contienen 12,5 mg ml -1 Chl y 4 mg ml -1 tetraciclina (Tet) a la cultura GBAA BAC recuperado. Crecer elBAC GBAA cultivo O / N a 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm. NOTA: La eficiencia de transformación de la electroporación el plásmido superenrollado GBAA es suficientemente alta para permitir el crecimiento de saturación de O / N en medios líquidos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de Inserción Casetes y Subclonación plásmidos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para incorporar HA en el casete (s) de inserción y el plásmido subclonación, lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los oligos largo modificados como se describe a continuación. <ol><li> Opcional: para evitar plásmido arrastre en la reacción recombinería, utilice un origen R6K o plantilla plásmido estrecho rango de huéspedes similar a amplificar el casete de inserción. </li><li> Alternativamente, linealizar el plásmido plantilla usando un compendio RE (Tabla 2). Elegir un RE que corta fuera de la región amplificación por PCR y es inactivado por calor. El calor inactiva la RE como recomienda la manufacturer. </li><li> Configurar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un sistema de ADN hotstart polimerasa de alta fidelidad. Preparar una mezcla maestra de PCR como se detalla (Tabla 3). Realizar ciclos térmicos como se muestra (Tabla 3). </li></ol></li><li> Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargar 1-5 l de cada PCR en un 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene 0,5 mg ml -1 bromuro de etidio (EtBr). NOTA: La presencia de productos de amplificación no específicos no interfiere en la reacción recombinería. En algunos casos, sin embargo, dímeros de cebadores pueden disminuir la eficiencia recombinería. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR. <ol><li> Opcional: eliminar la plantilla plásmido de PCR mediante tratamiento con DpnI seguido por PCR de limpieza. Eluir el ADN en un volumen mínimo de agua desionizada estéril (según lo recomendado por el fabricante). NOTA: La adición de DpnI para no purificado de PCR reacciones resultados en reducción de la eficacia de la escisión del XXe plantilla de ADN plásmido metilado. </li></ol></li><li> Cuantificar PCR de ADN amplificado mediante análisis en gel de agarosa en contra de un conjunto conocido de patrones de ADN, por ejemplo, λ digestión con HindIII o mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> 5. Subcloning Plus Inserción <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diluir la O / N BAC GBAA cultivo de 50 veces mediante la adición de 200 l en 10 ml de LB + Chl + Tet. Crecer en 30 &#160; ° C con agitación a 200 rpm durante 1 hr 50 min. Incluir una muestra a ser utilizada como control negativo. </li><li> Enfríe todos los materiales y equipos recombinería a 4 ° C como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Verter LB agar pH 8 placas que contienen la concentración correcta del antibiótico selectivo apropiado (s) que permita la selección del fragmento de ADN que se inserta, así como para la selección del vector de subclonación (Tabla 4). NOTA: Algunos antibióticos son sensibles al pH. Uso LBagar pH 8 como una regla. </li><li> Preparar una solución al 10% de L-arabinosa (v w /). Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. NOTA: arabinosa induce la expresión de las proteínas recombinería a partir del plásmido GBAA. </li><li> Compruebe el diámetro exterior de la cultura GBAA BAC utilizando un espectrofotómetro. Una vez que un OD 600 de 0,25-0,3 se alcanza, inducir a las proteínas recombinería como se describe en el siguiente paso. </li><li> Añadir 200 l de la solución de arabinosa 10% a 10 ml del cultivo de BAC para lograr una concentración final de 0,2% de arabinosa. Incluir un cultivo no inducido (sin arabinosa) para ser utilizado como control negativo. </li><li> Transferir la cultura BAC a un 37 &#160; ° C incubadora de agitación e inducir la expresión Roja durante 45 minutos con agitación a 230 rpm. NOTA: La expresión de proteínas rojas es ineficiente a 30 ° C. </li><li> Centrifugar las células y lavar con 10% de glicerol 3 veces tal como se describe en el paso 3.1.5. </li><li> Añadir 600-1,000 ng de cada uno del plásmido subclonación y el casete (s) de inserción a la reacción recombineering. Incluir un único vector y vector más Insertar controles individuales para comprobar el dominio de la recombinación y la integridad del vector y los cassettes. </li><li> Obtener una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo. Realizar electroporación como se describe en el paso 3.1.7 y posterior recuperación en 1 ml de LB a 37 ° C durante 1 hora para los plásmidos multicopia o en 10 ml de LB a 37 ° C durante 3 horas para los vectores del BAC. </li><li> Placa de diferentes diluciones de la cultura por ejemplo, recuperado, 90%, 10%, 1% en las placas de agar de doble selección y crecer a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li></ol> 6. Análisis de recombinantes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Opcional: Pick 6 a 12 colonias y realizar colonia PCR utilizando un cebador flanqueante HA y un cebador específico de inserción. Incluya el plásmido subclonación y el cas de inserciónplásmido Sette, así como el clon BAC padre como controles negativos. <ol><li> Realizar análisis en gel de agarosa de los PCR de colonias. Identificar los clones positivos por la presencia de una banda brillante en el tamaño esperado. NOTA: La alta eficiencia del proceso de clonación recombinantes SPI genera principalmente correctos. </li></ol></li><li> Escoja colonias en 5 ml de LB pH 8 que contiene el antibiótico selectivo y crecer O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar minipreparaciones de ADN utilizando un kit de purificación de la columna según las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar ADN miniprep BAC utilizando el aislamiento de fenol-cloroformo estándar o un protocolo similar. </li><li> Realizar digiere RE en el ADN miniprep. ADN separadas por electroforesis en gel de agarosa. Analizar los patrones de RE para identificar los clones que contienen los fragmentos de tamaños esperados del vector de orientación correcta. Elija un RE que discrimina claramente entre el inserto (s) vector que carece y el vector que contiene el inserto (s). </li><li> Optional: para obtener células que carecen de la BAC, que todavía está presente en la E. coli después recombinería, utilice el ADN plásmido miniprep transformar DH5alfa o DH10B E. células de E. coli. </li><li> Realizar la secuenciación de ADN a través de la HA y el casete de inserción para comprobar errores de síntesis de oligo. </li></ol>

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	<li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+1+(HDAC1),+but+not+HDAC2,+controls+embryonic+stem+cell+differentiation.">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li><li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice.">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li><li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4.">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li><li>Hasty, P., Rivera-P&#233;rez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells.">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li><li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors.">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li><li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-strand-break+repair+model+for+recombination.">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li><li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F., Soriano, P. M., Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+pipeline+to+make+conditional+targeting+constructs.">A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs.</a> Methods Enzymol. 477, 125-144 (2010).</li><li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli.">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li><li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination.">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli.">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li><li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering.">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+&#955;+red+recombination.">An improved recombineering approach by adding RecA to &#955; red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li><li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria.">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting.">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecE/RecT+and+Redalpha/Redbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners.">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li><li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination.">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).</li><li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate.">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li><li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations.">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li><li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction.">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).</li><li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli.">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li><li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA.">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis.">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes.">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li><li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors.">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li><li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease.">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li><li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

Construcción de líneas de células madre embrionarias y modelos de ratón históricamente ha incluido la orientación de genes utilizando construcciones de plásmidos que contenían el alelo modificado 4. Sin embargo, la construcción de estos vectores complejos orientación de genes ha demostrado ser un cuello de botella significativo en la producción oportuna de tales modelos. El desarrollo de estrategias de construcción vector recombinería basada ha permitido mejorar los diseños vectoriales y montaje vector más eficiente. Sin embargo, los protocolos recombinería actuales todavía implican varios pasos, requieren de purificación de plásmido intermedio y utilizan diferentes cepas bacterianas. Subclonación de inserción plus ofrece un nuevo enfoque para la construcción de vectores que se pueden realizar en un solo evento electroporación en la cepa huésped BAC residente. La utilidad de SPI en la dirección de genes fue probado aquí en una variedad de aplicaciones de construcción del vector. En todos los casos examinados aquí, SPI demostró ser eficiente y se produjo el plásmido recombinante correcta.En la mayoría de los casos, las múltiples cintas de diferentes fueron insertados correctamente en el vector de direccionamiento. Grandes casetes de ADN y vectores fueron alojados fácilmente en el protocolo SPI y demostraron la flexibilidad de este sistema. SPI se basa en el uso de secuencias de homología largas y fosforotioato (PTO) la protección de los casetes de ADN lineales. Modificación PTO confiere protección contra exonucleasas al ADN lineal 20,21 y la larga HA aumenta la eficiencia de recombinación para permitir la multiplexación. Sin embargo, la síntesis de secuencias de oligo largos aumenta las posibilidades de acumulación de errores especialmente supresiones. Las mutaciones en el oligo pueden ser particularmente perjudicial si cubren regiones codificantes de proteínas. La secuenciación del ADN a través de la HA y cubre la longitud completa de la cinta insertada es muy recomendable para eliminar clones con las alteraciones de la secuencia. También se sugiere el uso de un sistema de ADN polimerasa de alta fidelidad para evitar la introducción de unaerrores y PCR. La longitud y la composición de la HA del plásmido subclonación es más crítica respecto a la de la casete de inserción (datos no mostrados). Para aplicaciones especialmente sensibles como la construcción de vectores knockin, donde no se toleran las mutaciones en las regiones de exón, la HA del casete de inserción se puede acortar (50-120 pb) para evitar problemas asociados con oligos largos. El casete de inserción también se puede dejar phosphorothioated no modificada o dual (donde el conocimiento de la dirección de la replicación no está disponible). Pero multiplexación en estos casos todavía requiere mucho protegidos HA plásmidos subclonación. Una advertencia de esta estrategia particular es la disminución de la eficiencia de multiplexación que potencialmente pueden afectar SPI clonación en diferentes loci. La longitud de la casete de inserción y el plásmido subclonación es otro parámetro importante en el SPI clonación. Moléculas de ADN más grandes electroporar menos eficiencia y el efecto es acumulativo, dada la rerequisito de introducir todos los casetes en la misma célula (datos no mostrados). La multiplexación es más eficiente con casetes de inserción más pequeños. Fragmentos de ADN mayores de 3 kb también poner un límite en el procesamiento de ssDNA Roja mediada, que es más eficiente hasta 3 kb 30. Casetes Inserción de más de 3 kb son duales resecado y recombinan menos eficiente a través de una vía independiente beta 20. Por lo tanto, la detección de colonias suficientes para identificar el clon correcto se vuelve importante en estos casos. Una mayor duración de la post electroporación recombinación también aumenta las posibilidades de recuperación del clon correcto en ejercicios difíciles SPI. Hasta cuatro cassettes pequeños (&lt;1,5 kb) pueden ser insertados simultáneamente con el proceso de SPI, aunque la eficiencia de multiplexación disminuye con cada casete adicional (datos no mostrados). Sin embargo, esto refleja el resultado de un experimento óptima SPI y es recomendable tener en cuenta los límites de multiplexación cuando se utiliza muchas grandes cassettes. </p&gt; El desarrollo de herramientas de edición del genoma como agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) Sistema endonucleasa -cas9 ha permitido la creación de nuevas modificaciones del genoma y ha llevado a la ingeniería del genoma más eficiente 36. Sin embargo, estas nuevas tecnologías han complementado vectores de genes objetivo en lugar de ellos suplantado. Se prevé que el sistema de CRISPR-cas podría sustituir a la selección de antibióticos y perfeccionar el protocolo recombineering multiplex.

El desarrollo de tecnologías de segmentación de genes ha permitido la construcción de líneas celulares y modelos de ratón para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. Una primera etapa clave en la modificación de una secuencia genómica es el diseño y la construcción de un gen vector dirigido 4. Vectores de abordaje son construcciones de plásmidos que llevan el alelo de interés que contiene las modificaciones deseado (s) flanqueados por un marcador de selección (por ejemplo, neomicina), y las regiones genómicas largos requeridos para la recombinación homóloga eficiente en células de mamífero 5. Modificación del gen preciso se consigue mediante la introducción del vector de orientación en células madre embrionarias (ES) 6 o células somáticas 7, con lo cual la recombinación homóloga entre tramos idénticos de secuencia de ADN en el vector de direccionamiento y los resultados locus genómico en la transferencia de la modificación prevista al genoma mediante conversión génica 8. Tal modified células ES pueden ser inyectadas en blastocistos de ratón para producir descendencia (quimeras) que luego pueden transmitir estos alelos modificados a través de la línea germinal 9. Una ruta alternativa para producir ratones transgénicos implica la microinyección de un vector de expresión de genes en cigotos de ratón unicelulares, que conduce a la integración aleatoria del vector en el genoma del ratón 10. Los métodos tradicionales de la construcción del vector se han basado en convencional &#39;cortar y pegar&#39; clonación usando enzimas de restricción y ligasas de ADN para clonar el marcador de selección diferente y fragmentos genómicos en un esqueleto del vector. Sin embargo, un factor limitante inherente de clonación tradicional es el posicionamiento y la elección de los sitios de restricción, especialmente con secuencias de ADN más largos. Esto a menudo requiere múltiples etapas de subclonación y también introduce las secuencias de ADN extrañas en el vector, que a menudo conduce a una menor eficiencia de la orientación de genes. Recombinería (eng recombinogenicineering) es una tecnología de la ingeniería de ADN que supera estas limitaciones mediante el uso de recombinación homóloga (HR) mediada por las proteínas de recombinación del fago en E. coli células 11,12. Dado que cualquier región de una secuencia homóloga puede servir como un sustrato de recombineering, se eliminan las limitaciones de disponibilidad de sitios de restricción. Las secuencias de ADN de gran tamaño pueden ser modificados sin problemas directamente in vivo, por tanto, también la preservación de su integridad estructural 13. Recombinería es muy eficiente con homologías cortas (50 pb) 14 y por lo tanto brazos de homología (HA) pueden ser convenientemente incorporados en las secuencias de oligo sintéticos. En un experimento típico recombinería, un oligo o un fragmento de ADN bicatenario (dsDNA) contiene HA se electroporación en recombinería E. competente células de E. coli que contienen el objetivo situado ya sea en el cromosoma o en un plásmido 15. El potencial de recombinación es conferida por la expresión inducible de la rec Redombination proteínas del fago 16,17 o las proteínas RECET del profago rac 18. La exonucleasa Red / RecE convierte dsDNA lineales a un ADN monocatenario (ssDNA) intermedio, que luego se une por su socio, Red / RecT, una proteína de recocido de una sola hebra (SSAP) 19. El recocido de una larga ssDNA o un corto oligo a su secuencia diana complementaria se produce en el capítulo menos del tenedor de replicación y conduce a la incorporación de la secuencia en el sitio diana. Retardamien hebra ssDNA recombinación es la base de la alta eficiencia de recombineering y puede ser descrita por el &quot;beta&quot; modelo de recombinación 20,21. Un flujo de trabajo típico recombinería para construir un vector de orientación de genes involucra cualquiera de las dos siguientes rutas. Una ruta implica la subclonación de la región genómica deseada de un clon BAC de ratón en un plásmido seguido de la inserción secuencial de sitios de recombinación LoxP, un marcador de selección <shasta&gt; 22 etc., o la ruta alternativa implica la orientación del BAC locus genómico con los diferentes elementos de la orientación del vector de múltiples rondas de recombinería 10,23 y después subclonando el locus modificado en un plásmido mediante reparación brecha clonación 24,25. Variaciones sobre este tema se han utilizado en diferentes tuberías recombinería de alto rendimiento como parte de los programas de producción de gran ratón 26,27. Sin embargo, estos procedimientos implican etapas complicadas y largas, requieren el uso de vectores especializados y E. coli cepas (por ejemplo, células que expresan Cre) y utilizar una o más etapas intermedias de purificación de ADN vector y re-transformación (Tabla 1). Subclonación de inserción más (SPI) es una técnica recombineering novela que combina beta recombinación y reparación brecha de la clonación en un único proceso (Figura 1). Montaje vector SPI es simple, rápida y flexible y ofrece una mejora significativa en recombi estándaringe- se acerca (Tabla 1). Aquí, nos demuestran la facilidad y utilidad de usar SPI para diferentes aplicaciones en la construcción del vector con un énfasis particular en la construcción de diseños de vectores no estándar y desafiantes. Los casos de prueba incluyen la construcción de un vector knockin indicador fluorescente, una expresión de la proteína etiquetada vector knockin dual, un fluorescente reportero vector BAC y un vector knockout condicional. Estos examinaron diversamente el requisito de localizar un receptor de superficie celular, purificar un complejo de proteína nuclear o condicionalmente ablación de la expresión de un gen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K vistas.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Video: Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Investigación

Biología

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para las pruebas de la toxicidad de la novela química insecticida para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...