This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Este protocolo se basa en los siguientes recursos, que han de ser remitidos para más detalles y consideraciones especiales 3, 25-28. 1. Densidad juego de micelas de detergente con 2 H 2 O Nota: La densidad de la solución tampón debe ser adaptada a la densidad de las micelas de detergente. Agentes de ajuste de densidad comunes incluyen 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 O 18, glicerol y sacarosa 29. H 2 18 O tiene la misma densidad que 2 H 2 O y puede ser una mejor opción si no se desea deuteración de protones intercambiables en la proteína. En este procedimiento, la densidad de 3- -propanesulfonate (C14SB) detergente (N, N-dimethylmyristylammonio) en 50 mM Tris pH 7,3, NaCl 100 mM será comparado con el 2 H 2 O. Como una aproximación inicial las siguientes concentraciones de2 H 2 O se utilizará: 10, 30, y 50% v / v. 1.1. Preparación de la muestra <ol><li> Preparar las siguientes soluciones madre y del filtro de esterilización a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras: 50 ml de Tris 500 mM pH 7,3 y NaCl 1 M (solución tampón 10X); 1 ml C14SB 250 mM (solución de detergente 50X). </li><li> Preparar 200 l de solución de la muestra por mezcla de 20 l solución tampón 10X, 50X solución de 4 l de detergente, 20 l 2 H 2 O (99,9%) y 156 l H 2 O. desionizada También preparar 200 l de solución de referencia mediante la mezcla de 20 l solución de tampón 10X, 20 l 2 H 2 O (99,9%) y 160 l H 2 O. desionizada </li><li> Repita el paso 1.1.2 para las otras 2 H 2 O concentraciones, es decir, 30% y 50%, ajustando las cantidades 2 H 2 O y H 2 O apropiadamente. </li></ol> 1.2. Asamblea de 6 canales AUC células y carga de la muestra en las células. Nota: Hay dos tipos de células AUC en función del método de carga de la muestra. Las células sin relleno externo tiene que ser cargado antes de sellar la celda, mientras externa-llenan las células se pueden cargar después de que las células están sellados. Asamblea de una célula AUC-llenar externa se ha descrito previamente 3. En este protocolo, se describe el montaje de una célula AUC de 6 canales sin llenado externo. La principal diferencia es que tiene anillos de los tornillos en ambos lados que deben ser apretados por separado, y no necesita tapones de vivienda (Fig. 1). La diferencia en los pasos de armado, se destacan a continuación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Figura 1. Vista de una célula AUC de 6 canales sin relleno externo de despiece. Esta cifra ha sido modificado de Beckman Coulter An-50 y An Ti-Ti 60 Analytical Rotor, células, y el manual de usuario de contrapeso. <ol><li> Prepare dos montajes de ventana para cada celda AUC con ventana de zafiro en lugar de ventana de cuarzo (Fig. 2). Coloque la junta de la ventana en el soporte de la ventana. Doble ligeramente el revestimiento ventana y colocarlo en el soporte de la ventana de tal manera que la brecha se forma opuesta al chavetero titular ventana. Coloque la ventana de zafiro en el interior del forro ventana, alineando la marca con la ranura titular ventana. Nota:. La ventana de cuarzo es compresible y por lo tanto producirá la refracción más luz a alta velocidad 28, 30 Por lo tanto para las mediciones de interferencia por encima de 30.000 rpm, como en este experimento coincidente densidad, se utilizan ventanas de zafiro. Una ventana de zafiro es más pesado que la ventana de cuarzo y tiene una &quot;X&quot; grabado en su lado. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Figura 2. Despiece of el conjunto de ventana. Esta cifra ha sido modificado desde Beckman Coulter An-50 y An Ti-Ti 60 Rotor Analítica, células, y el manual de usuario de contrapeso <ol><li> Coloque la carcasa de la célula con el número de pieza al revés. Con las ranuras alineadas con la llave de la vivienda, deslizarse en la carcasa de la célula en primer lugar una pieza central 6 del sector con el lado biselado hacia abajo, seguido de un conjunto de ventana con la ventana hacia abajo (Fig. 1, izquierda). </li><li> Cubra ligeramente el anillo de hilos de rosca y anillo roscado lavadora con spinkote. Coloque una arandela anillo de tornillo en la parte superior del conjunto de ventana. Instale el anillo de tornillo en la carcasa ventana con la palabra &quot;OUT&quot; mirando hacia fuera. Apriete a mano el anillo roscado con la función de alineación celular. </li><li> Utilizando la llave de torsión, apriete la rosca a sólo 60 pulgadas-libras. </li><li> Coloque la celda con el número de pieza en posición vertical y se coloca a los 12 del mediodía. Load 120 l referencia en las filas izquierda y 110 l de muestra en las filas correctas. Asegúrese de que cada muestra y la referencia se empareja correctamente. Nota: volumen de la muestra exacta no es crítica, pero la referencia necesita tener un poco más de volumen que la muestra (5-10 l) de modo que el menisco de la muestra será distinta. </li><li> Deslice con cuidado en el montaje de la cubierta celular una ventana con la ventana hacia abajo (Fig. 1, derecha). Tenga cuidado de no molestar a la celda en exceso y derramar el contenido. </li><li> Repita el paso. 1.2 3 y 1.2. 4, apretando el segundo anillo de tornillo a 120 libras por pulgada. Invierta la celda y vuelva a apretar el primer anillo tornillo a 120 libras por pulgada. </li><li> Cargar las células en el rotor, instalar el rotor en la centrífuga e instalar el monocromador de acuerdo con las instrucciones del fabricante 28. Nota: Los detalles sobre este step también se puede encontrar en esta referencia 3. </li></ol> 1.3. Configuración de medición de interferencia <ol><li> Iniciar el software de interfaz de usuario para el instrumento AUC y realizar la configuración y calibración de láser radial para cada celda a 3000 rpm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que se resumen brevemente en la siguiente etapa. </li><li> Se ha alcanzado 1.3.1.1 Después de vacío suficiente (&lt;100 micras), ejecute el centrifugar a 3000 rpm. Vista previa de la figura de interferencia en el software de interfaz de usuario y ajustar los parámetros del láser para obtener el mayor contraste. </li><li> Crear una nueva creación de archivos (File | New File) especificando &quot;Equilibrio&quot; y &quot;Interferencia&quot; medición. Configuración de un método de equilibrio de sedimentación (botón &quot;Método&quot;) funcione a 45.000 rpm o la velocidad máxima prevista para las muestras de proteínas, lo que sea mayor, con la temperatura del plazo a 20 ° C y recoger 1 lectura cada 15 minutos. Monitor equilibrio progreso mediante la apertura de los archivos de datos en HeteroAnalysis y seleccionando la función &quot;Match&quot; después de al menos 12 horas (aproximadamente durante la noche, Fig. 3). Nota: una función similar también está disponible en SEDFIT (Opciones | Opciones de Carga | Test de aproximación al equilibrio). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Figura 3. El resultado de la función HeteroAnalysis Partido. La función de ajuste puede ser utilizado para monitorear el progreso de equilibrio comparando RMSD entre exploraciones sucesivas y el último análisis. Este ejemplo muestra consecución de equilibrio después de 8 horas como se indica por los valores asintóticos a RMSD eje x. 1.4. Análisis de los datos <ol><li> Para cada conjunto de muestras, trazar la pendiente del perfil de distribución radial en contra de la 2 H 2 O concentración. Nota: La distribución será una muy superficial exponencial que apenfoques linealidad. Intercepción del eje X corresponde a la búsqueda de una concentración de 2 O 2 H. </li><li> Para obtener resultados más precisos, realizar el experimento en varias repeticiones. Alternativamente, repetir el experimento con una gama más reducida de 2 H 2 O concentración. </li></ol> 2. La sedimentación de equilibrio de SH en micelas C14SB 2.1. Parámetro de desplazamiento <ol><li> Calcular la densidad de tampón y la viscosidad, la proteína de volumen específico parcial y la velocidad de centrifugación mediante el uso de SEDNTERP. Para calcular la densidad de búfer y la viscosidad, seleccione Calcular en la sección &quot;Buffer de datos Seleccione&quot; e introduzca los componentes del tampón en consecuencia, incluyendo el D 2 O concentración. </li><li> 2.1.1.1 Para calcular proteína volumen específico parcial, seleccione Calcular en la sección &quot;V-bar&quot; y escriba la secuencia de aminoácidos de la proteína. Especifique el tamaño oligomérica esperado más alto en &quot;Hacer un oligómero de este monómero: N =&quot;campo, en este caso N = 5. Calcular la velocidad al introducir los valores en el campo de RPM en la ventana principal hasta σ ≈ 1; esta es una regla de oro para garantizar una buena forma exponencial del perfil de distribución radial 25. Nota: Los valores calculados para este experimento fue la siguiente: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16.000 rpm. </li><li> Calcula las velocidades posteriores a seguir para garantizar la suficiente diferencia entre el perfil de distribución a una velocidad y el siguiente 25. Nota: Esto también se puede hacer desde la función &quot;Estimar rotor equilibrio acelera función&quot; en SEDFIT, que tiene en cuenta la columna de la solución (volumen de llenado). </li></ol> 2.2. Preparación de las muestras <ol><li> Prepare la solución de 1 ml de referencia con 5 mM C14SB y el 32,3% 2 H 2 O como se determina a partir de experimento a juego densidad (sección 1), mediante la mezcla de 100 l SOLUTIO tampón 10Xn (paso 1.1.1), 20 l de 50X solución de detergente (etapa 1.1.1), 323 l 2 H 2 O (99,9%) y 527 l desionizada H 2 O. </li><li> Disolver liofilizada, péptidos SH purificados por HPLC (expresión y purificación descrito previamente 31) en un disolvente apropiado tal como metanol o 50% v / v de acetonitrilo acuoso. Mida A280 de los péptidos disueltos en un microlitro escala espectrofotómetro UV / Vis y alícuota para tres muestras para dar un 280, 12 mm = 0,3, 0,5, y 0,8 (A 280, 10 mm = 0,25, 0,417, y 0,67) cada uno cuando se diluye hasta 130 l. Liofilizar las muestras durante la noche y volver a suspender en 130 l solución de referencia (paso 2.2.1) para dar las soluciones de muestra. Nota: la proteína SH se puede detectar de UV / Vis absorbancia a 280 nm, ya que contiene residuos de Trp y Tyr. Las proteínas sin residuos aromáticos pueden ser detectados mediante el etiquetado con un cromóforo adecuado, usando un mutante Trp-que contiene, o utilizando interfieremediciones NCE en lugar de absorbancia. </li><li> Siga los pasos de la sección 1.2 para montar una célula AUC de 6 canales con ventanas de cuarzo. Cargar la muestra de mayor concentración (A 280, 12 mm = 0,8) en el canal más cercano al centro del rotor y la más baja concentración de la muestra (A 280, 12 mm = 0,3) más alejado del centro del rotor. </li></ol> 2.3. La creación de medidas de absorbancia <ol><li> Crear una nueva creación de archivos (File | New File) especificando &quot;Equilibrium&quot; y valoración &quot;de Absorción&quot;. Especificar 280 nm como la longitud de onda del detector. </li><li> Realice la calibración radial a 3000 rpm marcando &quot;calibración radial antes de la primera exploración&quot; en Opciones de análisis, especificando la recopilación de datos a baja resolución, por ejemplo, con tamaño de paso radial = 0.01 cm, repeticiones = 3 (baja resolución, rápido), y ejecutar una exploración individual . Una vez finalizada la exploración, desactive la opción. </li><li> Configuración de un método de equilibrio de sedimentación (&quot;methobotón &quot;) d funcione a la primera velocidad calculada en el paso 2.1.3, a 20 ° C, y recoger 1 exploración cada 30 minutos. En &quot;Detalle&quot; &#39;cada célula, especifique la recopilación de datos a baja resolución como en el paso 2.3.2. Monitorear el progreso de equilibrio mediante la apertura de los archivos de datos en HeteroAnalysis y seleccionando la función &quot;Match&quot; después de al menos 18 horas (durante la noche aproximadamente, Fig. 4). Nota: logro del equilibrio puede tomar tiempo sustancialmente más largo para la primera velocidad, mientras que las velocidades posteriores tardarán menos tiempo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Figura 4. Los resultados de la función HeteroAnalysis Partido. La primera y segunda velocidades (arriba izquierda y derecha) parecen haber alcanzado el equilibrio, pero es mejor esperar unas horas más para estar seguro. En comparación, la tercera y cuarta velocidades (abajo a la izquierda y derecha) claramente han alcanzado el equilibrioen un tiempo más corto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Una vez que se ha alcanzado el equilibrio, se recoge una sola exploración en alta resolución, por ejemplo, con tamaño de paso radial = 0,001 cm, repeticiones = 10 (alta resolución, lento). </li><li> Una vez finalizada la exploración, repita el paso 2.3.3 y 2.3.4 para la siguiente velocidad. </li><li> Opcionalmente, cuando el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio para cada velocidad es conocida (calculada o por experiencia), configurar la exploración método de equilibrio de sedimentación para incluir todas las velocidades calculadas en el paso 2.1.3 y recoger 1 scan después de que el tiempo de equilibrio para cada la velocidad. En este caso, especifique la recopilación de datos en alta resolución &quot;Detalle&quot; &#39;cada célula. </li></ol> 2.4. Análisis de los datos en SEDFIT y SEDPHAT Nota: Para más detalles y consideraciones en lector de análisis de datos se denomina to la siguiente página web: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Exploraciones abiertas de alta resolución en SEDFIT (Datos | datos de equilibrio de sedimentación de carga) y se separaron los datos en 3 canales (estos corresponden a diferentes concentraciones para cada muestra; Opciones | Cargando Opciones | Guardar datos sin procesar de 6 canales en 3 subconjuntos). </li><li> Vuelva a abrir los archivos de datos que pertenecen a la misma muestra y la misma concentración, pero diferentes velocidades en SEDFIT. Ajustar el menisco (línea vertical roja), fondo de la celda (línea vertical azul) y los límites de ajuste (líneas verticales verdes), y exportar los datos para su uso en SEDPHAT (datos | Exportar datos a SEDPHAT). Entrada de los parámetros calculados en el paso 2.1.1, así como del tipo de rotor y el tipo de pieza central a lo solicitado. Repita este paso para cada muestra y la concentración. </li><li> Abre todos los datos de la misma muestra (todas las concentraciones y velocidades) en SEDPHAT y rellenar parámetros del experimento; un ejemplo se muestra en la Fig. 5. Nota: cuando se añade D 2 O en el búfer, deut<html> ración de protones intercambiables podría alterar significativamente el peso molecular de la proteína, especialmente para las proteínas solubles en agua. Las proteínas de membrana, especialmente los más pequeños, como la proteína SH, se ven menos afectados porque las regiones de membrana embebidos están protegidos de intercambio. Para corregir esto, de entrada el &quot;buffer D fracción mol&quot;. Nota: En este paso se recomienda guardar el conjunto de datos editado por separado seleccionando menú Datos | Copiar todos los datos y Guardar como una nueva configuración. </li><li> Seleccione un modelo y rellenar los parámetros globales para ese modelo. Nota: Como ejemplo, el modelo de &quot;Monómero-n-Mer autoasociación&quot; y sus parámetros se muestran en la Fig. 6. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Figura 5. Un ejemplo de cómo rellenar los parámetros experimentales. archivos / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Un ejemplo de cómo rellenar los parámetros globales para el modelo de monómero-n-Mer Auto-Asociación. <ol><li> Ejecutar un Fit Global seleccionando menú Fit | Global Fit y esperar hasta que converge en forma. Anote (o tomar una captura de pantalla de) los resultados apropiados, especialmente la reducción de chi-cuadrado global y log K a valores. Extracto de otros datos como los datos de ajuste y los residuos de ajuste de menú Copia y Display | Información de la pantalla termodinámica. </li><li> Regreso a los parámetros globales y comprobar M (1) para ajustarse al peso molecular del monómero y repita el paso 2.4.5. Anote el peso molecular amueblada y reducido chi-cuadrado global. </li><li> Repita el paso 2.4.3 a 2.4.6 para cada modelo a analizar y comparar la calidad apta de cada modelo comparando el valor reducido de chi-cuadrado global, así como los residuos de montaje. Nota: Los residuos de ajuste Pequeñas y aleatorios generalmente indica un buen ajuste, y el modelo que se adapta mejor haríatener la más pequeña reducción chi-cuadrado global. El peso molecular del monómero equipada y su valor de chi-cuadrado no deben diferir sustancialmente de la de la (teórico) de peso molecular fijo. </li><li> Calcular el intervalo de confianza para el registro obtenido Ka por valor seleccionando primero Estadísticas | Crítica chi-cuadrado para proyecciones de superficie error e introducir el intervalo de confianza deseado. A continuación, vaya a la Estadística | Generar proyección superficie de error 1-dimensional y anular la selección de log Ka en el diálogo de los parámetros globales para obtener los valores de chi-cuadrado para log Ka. Se aconseja a los lectores consultar las siguientes fuentes (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ SEDPHAT / statistics.htm) para más detalles sobre el método 32, así como ilustración de este método 33: Nota. </li></ol>

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W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este documento proporciona un protocolo experimental para la preparación y análisis de oligomerización de una pequeña proteína de membrana en detergente utilizando sedimentación equilibrio muestra. El protocolo descrito es igualmente válido -y simpler- para las proteínas solubles, como no se requiere la etapa de adaptación de la densidad. De hecho, el sistema está constituido por una mezcla de detergente y proteína. Para llevar a cabo estudios de sedimentación, el detergente debe ser invisible al campo gravi...

Ultracentrifugación analítica 1-5 es uno de los métodos más importantes para estudiar las interacciones de macromoléculas en condiciones fisiológicas, siendo accesible tanto a interacciones débiles y fuertes. El método es libre de etiquetas y utiliza la absorción de luz o interferencia, e incluso los sistemas ópticos de fluorescencia se puede utilizar para acceder a los intervalos de concentración en varios órdenes de magnitud 6. Este método es especialmente útil ya que la mayoría de los procesos bioquímicos dependen de las interacciones reversibles. La estequiometría y la fuerza de estas interacciones tienen que caracterizarse cuantitativamente a entender los procesos biológicos, y un número de métodos existen para este propósito 7, 8. Sin embargo, las interacciones transitorias son difíciles de estudiar 9. La elección de un método para caracterizar las interacciones macromoleculares depende de su naturaleza estática o dinámica. En el primer caso, Sedim<html> se utiliza la velocidad entación (SV), donde se mide la tasa de transporte radial y complejos se fraccionó sobre la base de diferencias en la masa flotante y forma. En contraste, las asociaciones dinámicas que son reversibles en la escala de tiempo del experimento no se pueden separar físicamente. En este caso, auto o hetero-interacciones que conducen a interacciones no covalentes están en un equilibrio que depende de la concentración de proteína total. Estas interacciones dinámicas pueden ser estudiados tanto por equilibrio de sedimentación (SE) y la velocidad de sedimentación (SV) 10. Sin embargo, el primer método es más simple de realizar y se describe aquí. En SE, la centrifugación se realiza a una velocidad suficientemente baja para que se alcanza un equilibrio entre la difusión y sedimentación. En este punto, el perfil de equilibrio de una señal óptica (UV-VIS) como una función de la distancia radial, se puede analizar utilizando modelos termodinámicos pre-establecido para asociaciones 11. ve_content &quot;&gt; En el presente trabajo, un estudio de equilibrio de sedimentación se presenta de la auto-asociación de una proteína de la membrana viral que forma canales iónicos. Debido a su hidrofobicidad, el experimento se ejecuta en presencia de detergente, y en este caso la densidad de disolvente tiene que ser adaptada a la del detergente. Sin embargo, el protocolo descrito sería idéntica en el caso de una proteína soluble en agua, excepto que se requeriría sin concordancia de densidad de disolvente. La proteína utilizada está codificada en el virus respiratorio sincitial humano (VRSh), un neumovirus envuelto en la familia Paramyxoviridae que causa la enfermedad de vías respiratorias bajas en los lactantes, los ancianos y las poblaciones inmunocomprometidas en todo el mundo 12. Hasta 64 millones de casos notificados de infección VRSh y 160.000 muertes ocurren cada año. El genoma VRSh transcribe 11 proteínas, incluyendo las tres proteínas de la membrana f, g, y una pequeña hidrófoba (SH). Proteína SH está involucradoen la patogénesis de la infección por RSV. RSV carece del gen SH (RSVΔSH) era viable, causó la formación de sincitios y creció así como la de tipo salvaje (WT) virus 13-16. Sin embargo, el virus de RSVΔSH replicado 10 veces menos eficiente que la WT en el tracto respiratorio superior 15, 16. Además, el virus RSVΔSH fue atenuada en vivo en el ratón y modelos de chimpancés 13, 17. La proteína SH es un (RSV subgrupo A) 64 o 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de longitud tipo II proteína integral de membrana que se acumula principalmente en las membranas de Golgi el compartimiento 18. Proteína SH tiene un solo predijo una hélice transmembrana (TM) de dominio 19 que está altamente conservada 20,21. Los dominios extramembrane C- y N-terminales están orientados lumenally / extracelularmente y el citoplasma, respectivamente. Tanto dominio sintético TM (residuos 18-43) Y la proteína SH de longitud completa se ha demostrado para formar homopentamers en una variedad de detergentes. La forma homopentamérica es responsable de la actividad del canal en bicapas lipídicas planas 22,23. La orientación correcta de los monómeros TM en la bicapa lipídica se determinó primero utilizando sitio dicroísmo infrarrojos específica 23, que mostró su-22 para estar en un luminal, cerca de inter-helicoidal, orientación. La misma orientación dominio TM fue confirmada por estudios de RMN que reconstruyen la pentamérica a-helicoidal paquete de la proteína de longitud completa en dodecylphosphocholine (DPC) micelas 22. En este modelo de &quot;micelas&quot;, un dominio TM helicoidal a- solo estaba flanqueado N-terminal por una a-hélice, y C-terminal por un b-horquilla extendida. Los dos residuos protonables de proteína SH, Su-22 y Su-51, se encuentran en el dominio TM (orientado lumenally), y en la punta de la extramembrane C-terminal de β horquilla (lejos del poro del canal), respectivamente. En un enviro bicellarnment, sin embargo, el TM α-hélice se extiende hasta Su-51, y los dos residuos de His son accesibles para el lumen del canal 24. La estructura de canal adopta una arquitectura similar a un embudo 22, en donde la región más estrecha (Ser-Cys-29 a 45) 22 se alinea con cadenas laterales hidrófobas (ILE-32, Ile-36, Ile-40 y Leu-44), y Ile-36 define el punto más estrecho en el lumen del canal. Su-22 se encuentra en la mayor apertura de este embudo, mientras que su-51 está en la punta de la abertura más pequeña. En el presente trabajo, centrifugación analítica en un modo de equilibrio de sedimentación se ha utilizado para determinar si su protonación afecta a la estabilidad de la proteína SH pentámero. En este caso, la proteína SH fue solubilizado en detergente C14-betaína, que se ha utilizado previamente para mostrar que las formas de la proteína SH oligómeros pentaméricas 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1345">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:448px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Deuterium oxide 99.8%</td>
			<td style="width:147px;">Cambridge Isotope</td>
			<td style="width:119px;">DLM-4-99.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell housing</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">334784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window holder</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window gasket</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">327021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window liner</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Sapphire window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">307177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Quartz window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw-ring washer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw ring</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Spinkote</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Torque stand assembly</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Counterbalance</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">360219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell alignment tool</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDNTERP</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HeteroAnalysis&#160;</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDFIT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedfit.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDPHAT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedphat/default.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para estudiar las interacciones reversibles entre macromoléculas a través de una amplia gama de fuerzas de interacción y bajo condiciones fisiológicas. Esto hace AUC un método de elección para evaluar cuantitativamente la estequiometría y la termodinámica de homo- y hetero-asociación que son transitorios y reversibles en los procesos bioquímicos. En la modalidad de equilibrio de sedimentación (SE), un equilibrio entre la difusión y sedimentación proporciona un perfil como una función de la distancia radial que depende de un modelo de asociación específica. En la presente memoria, un protocolo detallado SE se describe para determinar el tamaño y el monómero-monómero asociación de energía de un pequeño oligómero proteína de la membrana utilizando una ultracentrífuga analítica. AUC-ES es libre de etiquetas, solamente basado en principios físicos, y se puede utilizar en ambas proteínas solubles y de membrana de agua. Se muestra un ejemplo de este último, la proteína hidrófoba pequeña (SH) en el virus sincitial respiratorio humano (VRSh), Un polipéptido de ácido 65-amino con una sola transmembrana (TM) de dominio α-helicoidal que forma canales iónicos pentaméricas. Datos estructurales a base de RMN muestra que la proteína SH tiene dos protonable residuos de His en su dominio transmembrana que están orientados dirigida a la luz de la canal. SE experimentos han sido diseñados para determinar cómo afecta a pH constante de asociación y el tamaño oligomérico de la proteína SH. Mientras que la forma pentamérica se conservó en todos los casos, su constante asociación se redujo a pH bajo. Estos datos están de acuerdo con una dependencia del pH similares observados para la actividad del canal SH, en consonancia con una orientación lumenal de los dos residuos de His en la proteína SH. Este último puede experimentar la repulsión electrostática y la reducción de la estabilidad oligómero a pH bajo. En resumen, este método es aplicable siempre que la información cuantitativa sobre los cambios de asociación entre proteínas sutiles en condiciones fisiológicas tiene que medir.

El perfil radial de distribución de micelas de detergente C14SB en Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,3 formas exponenciales una muy superficial que podría ser instalado en un modelo lineal (Figura 7A). La pendiente de esta distribución está inversamente correlacionada con la concentración de D 2 O (Figura 7B). El punto donde la pendiente es cero, es decir, la correspondencia D 2 O concentración, se encontró que era 32,3%. Ver...

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Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

La sedimentación de equilibrio de una proteína de membrana pequeña formador de oligómeros: Efecto de la histidina protonación en pentamérica Estabilidad

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

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Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived phosphorescent signal when coordinated to a histidine-containing protein immobilized on the surface of a magnetic particle. Synthesis of Ir1, in high yields,is complete O/N&#160;and involves splitting of the parent cyclometalated Ir(III) chloro-bridged dimer into two equivalents of the solvated complex. To confirm specificity, several amino acids were probed for coordination activity when added to the synthesized probe, and only histidine elicited a signal response. Using BNT-II, a branched peptide mimic of the malarial biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), the iridium probe was validated as a tool for HRP-II detection. Quenching effects were noted in the BNT-II/Ir1 titration when compared to L-Histidine/Ir1, but these were attributed to steric hindrance and triplet state quenching. Biolayer interferometry was used to determine real-time kinetics of interaction of Ir1 with BNT-II. Once the system was optimized, the limit of detection of rcHRP-II using the probe was found to be 12.8 nM in solution. When this protein was immobilized on the surface of a 50 &#181;m magnetic agarose particle, the limit of detection was 14.5 nM. The robust signal response of this inorganic probe, as well as its flexibility of use in solution or immobilized on a surface, can lend itself toward a variety of applications, from diagnostic use to imaging.

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) luminiscentes Sonda para la detección de la proteína malaria biomarcador histidina Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

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Química

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

Dinámica electroquímico Medición de cloruro de iones

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Original Experimental Approach for Assessing Transport Fuel Stability

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several technological changes to fulfill environmental and economic requirements. These developments have resulted in increasingly severe operating conditions whose suitability for conventional and alternative fuels needs to be addressed. For example, fatty acid methyl esters (FAMEs) introduced as biodiesel are more prone to oxidation and may lead to deposit formation. Although several methods exist to evaluate fuel stability (induction period, peroxides, acids, and insolubles), no technique allows one to monitor the real-time oxidation mechanism and to measure the formation of oxidation intermediates that may lead to deposit formation. In this article, we developed an advanced oxidation procedure (AOP) based on two existing reactors. This procedure allows the simulation of different oxidation conditions and the monitoring of the oxidation progress by the means of macroscopic parameters, such as total acid number (TAN) and advanced analytical methods like gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflection (FTIR-ATR). We successfully applied AOP to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics of a model molecule (methyl oleate) and commercial diesel and biodiesel fuels. These developments represent a key strategy for fuel quality monitoring during logistics and on-board utilization.

Oxidation stability of transport fuels has become a concern for future fuel development. This work presents an original methodology developed by IFP Energies Nouvelles for assessing fuel stability using two different reactors. This methodology was successfully applied to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics and pathways of model molecules and commercial fuels.

Enfoque experimental original para evaluar el transporte de combustible Estabilidad

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Aplicación y metodología de la técnica de RMN no destructivos 19F dominio del tiempo para medir el contenido en medicamentos que contienen flúor

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical photocatalytic structures. However, the influence of such chemical bonding on the optical and surface properties of the photocatalyst and thus its photocatalytic activity/reaction selectivity behavior has not been systematically studied. In this investigation, TiO2 has been supported on the surface of SiO2 by means of two different methods: (i) by the in situ formation of TiO2 in the presence of sand quartz via a sol-gel method employing tetrabutyl orthotitanium (TBOT); and (ii) by binding the commercial TiO2 powder to quartz on a surface silica gel layer formed from the reaction of quartz with tetraethylorthosilicate (TEOS). For comparison, TiO2 nanoparticles were also deposited on the surfaces of a more reactive SiO2 prepared by a hydrolysis-controlled sol-gel technique as well as through a sol-gel route from TiO2 and SiO2 precursors. The combination of TiO2 and SiO2, through interfacial Ti-O-Si bonds, was confirmed by FTIR spectroscopy and the photocatalytic activities of the obtained composites were tested for photocatalytic degradation of NO according to the ISO standard method (ISO 22197&#8722;1). The electron microscope images of the obtained materials showed that variable photocatalyst coverage of the support surface can successfully be achieved but the photocatalytic activity towards NO removal was found to be affected by the preparation method and the nitrate selectivity is adversely affected by Ti-O-Si bonding.

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The focus of the present work is to establish means to generate and quantify levels of Ti-O-Si linkages and to correlate these with the photocatalytic properties of the supported TiO2.

El efecto de la unión química interfacial en TiO<sub2</sub&gt; -SiO<sub2</sub&gt; Composites en su desempeño fotocatalítico de reducción de NOx

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

The Effect of Charging and Discharging Lithium Iron Phosphate-graphite Cells at Different Temperatures on Degradation

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. The degradation of the cells is assessed by using 10 charging and discharging temperature permutations ranging from -20 &#176;C to 30 &#176;C. This allows an analysis of the effect of charge and discharge temperatures on aging, and their associations. A total of 100 charge/discharge cycles were carried out. Every 25 cycles a reference cycle was performed to assess the reversible and irreversible capacity degradation. A multi-factor analysis of variance was used, and the experimental results were fitted showing: i) a quadratic relationship between the rate of degradation and the temperature of charge, ii) a linear relationship with the temperature of discharge, and iii) a correlation between the temperature of charge and discharge. It was found that the temperature combination for charging at +30 &#176;C and discharging at -5 &#176;C led to the highest rate of degradation. On the other hand, the cycling in a temperature range from -20 &#176;C to 15 &#176;C (with various combinations of temperatures of charge and discharge), led to a much lower degradation. Additionally, when the temperature of charge is 15 &#176;C, it was found that the degradation rate is nondependent on the temperature of discharge.

This article describes the effect of dissimilar charging/discharging temperatures on the degradation of lithium iron phosphate-graphite pouch cells, aiming at simulating close to real case scenarios. In total, 10 temperature combinations are investigated in the range -20 to 30 &#176;C in order to analyze the impact of temperature on degradation.

El efecto de la carga y descarga de pilas de litio hierro fosfato y grafito a diferentes temperaturas sobre la degradación de

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. ...

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bis(thiourea) Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of 367 nm using the chemical bath deposition technique are studied comparatively. Two experiments are performed to make a comparison: one without UV light and the other with the aid of UV light. Both experiments are performed under equal conditions, at a temperature of 343 K and with a pH of 3.2. The precursors used are cadmium chloride (CdCl2) and thiourea [CS(NH2)2], which are dissolved in 50 mL of deionized water with an acidic pH. In this experiment, the interaction of electromagnetic radiation is sought at the moment the chemical reaction is carried out. The results demonstrate the existence of an interaction between the crystals and the UV light; the UV light assistance causes crystal growths in an acicular shape. Also, the final product obtained is cadmium sulfide and shows no evident difference when synthesized with or without the use of UV light.

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bisthiourea Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

This article presents a protocol for the synthesis of bis(thiourea) cadmium chloride crystals by chemical bath deposition. Two experiments are described: one aided by ultraviolet light compared to one without ultraviolet light.

El efecto de la radiación ultravioleta en la deposición química del baño de Bis(thiourea) cadmio cloruro cristales y la posterior obtención de CdS

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Extraction of Lignin with High &amp;#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Extracción de la lignina con alto contenido de β-O-4 por la extracción de etanol suave y su efecto sobre el rendimiento de despolimerización

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

Películas de óxido de niobio depositadas por sputtering reactivo: efecto de la tasa de flujo de oxígeno

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...