The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

NOTA: Consulte la Figura 2 para una visión general del flujo del proceso que comprende la preparación, las medidas de adquisición de datos y análisis de datos. 1. Reactivo de instalación NOTA: Todos los productos químicos deben ser manejados con cuidado, y por lo tanto una bata de laboratorio, se deben usar guantes y protección para los ojos. Todas las operaciones deben realizarse en una campana de laboratorio. En particular, guantes especiales deben ser usados ​​en caso de uso cloroformo. <ol><li> Utilice productos químicos con bajo contenido de agua como el cloroformo seco rápidamente y almacenar en seco, pero no más de una semana. Almacenar tanto los productos químicos a -20 ° C y bajo gas nitrógeno o argón porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (véase la Tabla 1) y PEG (polietilenglicol) son higroscópicos y PEG está sujeta a la oxidación en el aire. </li><li> Para evitar la exposición frecuente de las existencias al oxígeno atmosférico y la humedad, preparar alícuotas más pequeñas, idealmente dentro de un sistema guantera con un atmosphe nitrógenore. </li></ol> 2. Equipo de instalación NOTA: Para evitar una posible contaminación cruzada, utilice vasos fresca y limpia para cada paso. <ol><li> Cristalería limpia y pinzas en una solución de detergente durante 30 minutos en un baño de ultrasonidos a 60 ° C. </li><li> Enjuague y equipos sonicado desde el paso 2.1 dos veces a fondo con agua ultrapura. </li><li> Equipos de calor desde el paso 2.1 en solución RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno y amoniaco (5: 1: 1)) a 75 ° C en un horno durante 45 min y posteriormente enjuagar con agua ultrapura. </li><li> Por último, secar el material de vidrio y pinzas bajo una corriente de nitrógeno seco o en un horno (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Sugerencia funcionalización NOTA: Use pinzas, vasos, etc. hecho de acero inoxidable, PTFE, vidrio o cualquier otro material que es químicamente estable en soluciones orgánicas si es aplicable. A menos que se especifique lo contrario, llevar a cabo todos los pasos en RT. La cantidad de solución de incubación necesarios depende del número de chips en voladizo. Asegúrese de que los voladizos se sumergen en las respectivas soluciones en todos los tiempos. NOTA: Use una campana para evitar la inhalación de los vapores orgánicos. <ol><li> Formación de grupos OH en la superficie en voladizo (&quot;activación&quot;) (aproximadamente 0,5 horas): <ol><li> Use pinzas para colocar las fichas frescas en voladizo (materiales: SiN, constantes de primavera: 10 a 100 pN / nm) en un portaobjetos de vidrio limpio y los puso en una cámara de plasma (100 W). </li><li> Evacuar cámara (~ 0,1 mbar). </li><li> Cámara de inundación con gas oxígeno y evacuar de nuevo. </li><li> Activar el proceso de plasma (potencia: 20%, duración: 15 min, presión de proceso: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-silanización de voladizos (aproximadamente 1 hora): <ol><li> Preparar los 2,5 ml de solución APTES (ver Tabla 1) en una placa de Petri de vidrio - hacer esto muy bien durante el proceso de plasma. </li><li> Immediately después del proceso de plasma, sumerja cada voladizo durante 1 segundo en acetona y colóquelos inmediatamente después en la solución APTES. </li><li> Incubar durante 15 min a TA. </li><li> Enjuagar cuidadosamente las fichas en voladizo dos veces en 10 ml de acetona y una vez en 10 ml de cloroformo. </li><li> Opcional finales paso: Virutas Place voladizo desde el paso anterior en un portaobjetos de vidrio limpio y hornear durante 30 minutos a 70 ° C. Tenga en cuenta que también hay estrategias alternativas para la activación de la superficie, por ejemplo, tratamiento UV 12. </li></ol></li><li> PEGilación (aproximadamente 2 horas): NOTA: Realizar pasos 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanización. NHS y grupos maleimida están sujetas a la hidrólisis en ambientes acuosos y la propia PEG está sujeto a la oxidación en el aire. Por lo tanto temporización (especialmente entre los pasos) es un parámetro crítico. Consulte 13 para más información. <ol><li> Preparar la solución de cloroformo (ver Tabla 1). </li><li> Para evitar la condensación, Cálido PEG empolva hasta RT antes de abrir la alícuota y pesando la cantidad apropiada. </li><li> Para el acoplamiento de los polímeros o lípidos con grupos amino, por separado resolver NHS-PEG-NHS (6 kDa) y metil-PEG-NHS (5 kDa) en la solución de cloroformo por agitación hasta que se disuelvan completamente. Consulte la Tabla 1 para las concentraciones. <ol><li> Alternativamente. para el acoplamiento de polímeros con grupos tiol resolver por separado Mal-NHS-PEG y metil-PEG-NHS en la solución de cloroformo. </li></ol></li><li> Mezclar las soluciones según sea necesario para ajustar una cierta relación entre el número de NHS o la maleimide- y las moléculas de PEG terminado en metilo (típicamente 1: 500). Tenga en cuenta que la proporción ideal tiene que ser determinada de forma iterativa en una serie de ciclos de preparación-experimento. </li><li> Incubar las virutas en voladizo en la solución de PEG durante 1 hora en una atmósfera cloroformo saturado para evitar la evaporación del cloroformo. </li></ol></li><li> Sonda Conjugación molécula(&gt; 1 hora): NOTA: En el siguiente 3.4.1-3.4.3, se describen tres ejemplos para el acoplamiento covalente de diferentes moléculas de la sonda a la punta del AFM. Para cada molécula el protocolo tiene que ser ajustado. Nota además, que en el ejemplo 1 y 3 NHS-química se utiliza mientras que en el ejemplo 2 el tiol funcionalizado polímero PI- g -PS está acoplado a la PEG-maleimida a través de la química. Para más detalles ver 14. <ol><li> Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa) <ol><li> Disolver el politirosina conjugado molécula sonda en 1 M NaOH. Ajustar la concentración de 1 mg / ml. </li><li> Cambie el NaOH para tampón de borato de sodio (pH 8,1) utilizando columnas de desalación giro (7 kDa MWCO) inmediatamente antes de la funcionalización </li><li> Enjuagar los voladizos primero con 5 ml de cloroformo, después con 5 ml de etanol y finalmente con 5 ml de tampón de borato. </li><li> Incubar las fichas en voladizo durante 1 hora en la solución tampón de borato politirosina y luego enjuague con tampón de boratoy agua ultrapura. Almacene en agua ultrapura hasta que la medición. </li></ol></li><li> Para los polímeros con un esqueleto lineal (poliisopreno, 119 kDa) que tienen cadenas laterales injertadas (poliestireno, 88 kDa) 14 <ol><li> Se disuelve el PI g-PS en cloroformo seco. Ajustar la concentración de la solución de la conjugación a 4 mg / ml. </li><li> Enjuagar los voladizos con 5 ml de cloroformo y se incuba durante al menos 1 hr en la solución de conjugación. </li><li> Enjuague de nuevo en 5 ml de cloroformo y almacenar en cloroformo en un entorno de cloroformo-saturado (para evitar la evaporación de cloroformo) hasta que la medición. </li></ol></li><li> Para el Papa lípidos <ol><li> Disolver PAPA en cloroformo seco. Ajustar la concentración de 20 mM. </li><li> Enjuagar los voladizos con 5 ml de etanol y 5 ml de agua ultrapura antes de la incubación de los voladizos de 1 hr en la solución de lípidos. </li><li> Después de la incubación, enjuague voladizos con 5 ml de cloroformo, 5 ml de etanol y 5 ml de agua tibia y ultrapura (en este orden) para eliminar las moléculas de sonda sin unir y para deshacerse de los residuos de cloroformo. Utilice consejos funcionalizados inmediatamente. Alternativamente, guárdelos en cloroformo hasta que se necesite. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Esquema que muestra el proceso de funcionalización punta utilizando el ejemplo de la química NHS. De conexión (B) Química empleado para unir una molécula de sonda a la punta a través de un grupo amino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Preparación 4. Superficie <ol><li> Autoensamblada monocapa (SAM) NOTA: Como superficie para el primer ejemplo, se eligió una capa monomolecular auto-ensamblada. Consulte la literatura 15 </sarriba&gt; para obtener más información. <ol><li> Portaobjetos de vidrio limpios con una solución de detergente y luego dos veces en agua ultrapura en un baño ultrasónico durante 30 minutos cada uno. Entonces, como un paso adicional de limpieza, colóquelos en la solución RCA (véase el paso 2.3) a 75 ° C durante 15 minutos. </li><li> Cubra las diapositivas con 10 níquel cromo nm y 100 nm de oro en un dispositivo de recubrimiento de vacío. Entonces almacenar en la nevera y limpio de nuevo en la solución de RCA directamente antes de la siguiente etapa. </li><li> Incubar las diapositivas de la etapa anterior en solución 2 mM 1-dodecanthiol / etanol durante 12 h. Los grupos tiol se unen a la superficie de oro y una auto monocapa hidrófobo ensambla. Enjuagar los portaobjetos con etanol y agua ultrapura y luego seca mediante una corriente de gas nitrógeno. Confirmar la hidrofobicidad de la superficie preparada con las mediciones de ángulo de contacto estático en un goniómetro con una cámara CCD 10. </li></ol></li><li> Hidrógeno diamante terminado NOTA: Como una superficie para el segundo ejemplo, se eligió un diamante terminado hidrógeno. La preparación de la superficie se realizó como se ha descrito previamente 16. </li><li> Apoyado bicapa lipídica NOTA: En el último ejemplo, se usó una superficie soportada bicapa lipídica (SLB) como una superficie. Para obtener una superficie tal, una solución (0,1 mg / ml) de las vesículas unilamelares grandes (LUVs) consistentes en la POPC fosfolípido se formaron por el método de extrusión. A continuación, 50 l de la solución LUV fueron puestos en una hoja de mica recién escindido (A = 1 cm²) y se incubaron durante 30 min. Finalmente la solución se lavó con 20 ml de agua ultrapura. Ver 17,18 para una descripción detallada de la preparación de SLBS. </li></ol> 5. Adquisición de Datos NOTA: Para los experimentos, utilizar un AFM, que proporciona la capacidad de medir en líquidos. Los procedimientos de adquisición de datos y análisis de datos son aplicables independientemente del modelo utilizado AFM. Además, en algunos experimentos que es ventajoso tener la posibilidad de controlar la temperature dentro de la célula líquida. Deflexión Cantilever se detectó mediante el método de desviación del rayo láser 19. Constantes de resorte se determinaron con el método de ruido térmico 20. <ol><li> Introduce el voladizo funcionalizado en un soporte en voladizo AFM que es adecuado para medir en los fluidos. </li><li> Ponga la superficie (preparación véase arriba) para tomar muestras en el AFM y cubrir con líquido. Ambos, de consola y la superficie ahora deben sumergirse en el líquido con la punta en voladizo que apunta hacia la superficie. Tenga en cuenta que en muchos casos una gota de líquido es suficiente. En cualquier caso la evaporación del fluido debe ser evitado, por ejemplo, mediante el uso de una célula de fluido cerrada. </li><li> Si procede, ajustar la temperatura deseada en el controlador. </li><li> Deje que el sistema se equilibre durante al menos media hora. </li><li> Registrar un espectro de ruido térmico del voladizo con el voladizo lejos de la superficie a fin de excluir cualquier superficie efectos de amortiguación. Tenga en cuenta que por lo general 10 o más espectros tienen que ser acumulada para obtener una relación suficiente de señal a ruido. </li><li> Acércate a la superficie. Tenga en cuenta que con el fin de conservar la geometría de la punta y la punta funcionalización el proceso de enfoque tiene que ser llevado a cabo cuidadosamente. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, se aproxima en modo de contacto intermitente. </li><li> Determinar la sensibilidad óptica inversa palanca (InvOLS) medida en nm / voltios. Para ello, empujando la punta en voladizo contra una superficie dura. <ol><li> Determinar los InvOLS mediante la medición de la pendiente de la distancia de recorrido piezo vs. el cambio en la tensión de fotodiodo. Se ajusta una línea a la parte de la curva de fuerza-distancia donde la punta en voladizo está en contacto con la superficie. En experimentos con una superficie blanda como bicapas lipídicas, llevar a cabo este paso en las zonas que no están cubiertas con una bicapa lipídica (&quot;puntos de defectos &#39;). </li></ol></li><li> Determinar la constante de resorte (pN / nm) mediante el ajuste de un oscilador armónico con el espectro de ruido térmico. Usofunción de software automatizado para la determinación de la constante de muelle; o consulte la literatura 20. </li><li> Inicie el experimento. <ol><li> Curvas numerosa fuerza Récord de distancia en cada condición experimental. Por lo general, utilice los siguientes valores para los parámetros experimentales: Frecuencia de muestreo de 5 kHz, la velocidad punta de 1 m / seg, retraer distancia de 1 m. NOTA: A veces, dependiendo de la dinámica del experimento estudiado, podría ser necesario esperar una cierta cantidad de tiempo con la punta en contacto con la superficie (&quot;tiempo de permanencia &#39;). NOTA: El experimento parámetros específicos puede desviarse sustancialmente de los valores indicados anteriormente. </li><li> Durante las mediciones a largo plazo, cero la posición del láser en el fotodiodo de vez en cuando por el reposicionamiento del fotodiodo. </li><li> Opcional: Después de cada curva de la fuerza, la ubicación de la AFM-punta a otra posición xy. </li><li> Al final del experimento, determinar la sensibilidad y el resorte CONSTAnt de nuevo para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema. NOTA: La comparación de la constante de resorte y la sensibilidad antes y después del experimento es también un medio para asegurar que las propiedades del sistema y de las propiedades de la punta se mantuvo sin cambios en el transcurso del experimento. Si la diferencia de las constantes de resorte no es demasiado grande (&lt;= 15%), que se pueden promediar, ya que la incertidumbre intrínseca de la determinación de la constante de muelle es también alrededor de 15%. Para las diferencias más grandes, es aconsejable encontrar primero y eliminar la causa para el cambio constante aparente de primavera antes de continuar con otros experimentos. </li></ol></li></ol> 6. Preparación de datos NOTA: En esta sección general de los pasos de preparación de datos que se realizan normalmente independiente del tipo específico de experimento para convertir las unidades de Newton y nanómetro, así como para corregir los datos se describen. Los análisis de datos específicos experimento se briefly describe más adelante en la respectiva sección de ejemplo representativo. <ol><li> Típicamente, llevar a cabo toda la preparación y análisis de datos los pasos automáticamente mediante un algoritmo de casa-escrita, por ejemplo, basado en el software IGOR Pro 6. </li><li> Convertir la señal de deflexión prima (DEFL) [V] en vigor multiplicándolo con los InvOLS [nm / V] y la constante elástica [nN / nm]. </li><li> Offset la fuerza de tal manera que la fuerza sobre el voladizo en una distancia suficiente desde la superficie (en voladizo sin carga) se convierte en 0 nN. </li><li> Calcular la posición de la punta real (también llamado de separación cuando se mide con relación a la superficie) * z, que toma la flexión del voladizo en cuenta: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Offset z * de una manera tal que z * = 0 corresponde a la posición z de la superficie. NOTA: Aquí, F es la fuerza que actúa sobre la punta y por lo tanto dobladaEs el voladizo (determinado en el paso 6.2.), z es la posición z-sensor de medición (directa dada por el instrumento) y k representa la constante del resorte (determinado en el paso 5.8). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Figura 2. Proceso de diagrama de flujo que muestra la preparación de la muestra, la adquisición de datos y el análisis de datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Durante las últimas décadas, los experimentos de una sola molécula han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y que resultó ser un enfoque muy valiosa en ciencias de la vida y más allá. Para lograr buenas estadísticas y significativas de los experimentos SMFS, idealmente una y la misma molécula se utiliza en todo el curso del experimento. En contraste con los experimentos con conjuntos de moléculas, los experimentos SMFS son capaces de detectar eventos raros y estados molecu...

Durante los últimos 30 años, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha resultado ser una técnica de formación de imágenes valiosa para estudiar biológicos y sintéticos 1,2 3 materiales y superficies, ya que proporciona una resolución espacial molecular en las tres dimensiones y puede ser operado en varios disolvente ambientes. Además, AFM-fuerza única molécula de espectroscopia (SMF) permite medir las fuerzas que van desde la pN a μN régimen y ha dado una visión sin precedentes, por ejemplo, en el plegamiento de proteínas 4,5, física de polímeros 6-8, y la interacción molécula-superficie solo 9 - 12 .La razón detrás de estudio de las moléculas individuales en lugar de un conjunto de moléculas es evitar los efectos que a menudo enmascaran eventos raros o estados moleculares promedio ocultos. Además, una multitud de parámetros moleculares, tales como la longitud de contorno, la longitud Kuhn, la energía libre de adherencia, etc. puede serobtenido. Esto se detalla en los ejemplos siguientes. En un experimento típico de AFM-SMFS, la molécula de sonda se acopla a una punta muy afilada a través de una molécula de engarce. La punta en sí está situado en el extremo de un voladizo flexible. Si la punta se pone en contacto con la superficie de la molécula de sonda va a interactuar con esta superficie. Mediante la observación de la deflexión del voladizo después de la retracción de la punta, la fuerza, y por lo tanto la energía libre, para separar la molécula de la superficie puede ser determinada. Para obtener estadísticas significativas, un gran número de las llamadas curvas de fuerza-distancia tienes que estar adquirida. Además, para tener una verdadera experimentos sola molécula (es decir, utilizando una y la misma molécula de sonda sobre la duración de todo el experimento) la molécula sonda debe estar acoplado de forma covalente a la punta del AFM. Aquí, se presenta un protocolo experimental para funcionalización en voladizo con una sola molécula a través de un enlace covalente. La molécula sola o bien se puede acoplar a través de un amino o un tiol grupo a la punta del AFM. El proceso de conjugación se puede realizar en una amplia variedad de disolventes (orgánica y acuosa) para tener en cuenta las propiedades de solvatación de los polímeros utilizados. En la primera parte, un protocolo general para unir covalentemente una molécula única (&quot;molécula de sonda&quot;) a través de una molécula de unión a una punta de AFM se describe. Para este fin, NHS orgánico o maleimida-química se utiliza 13. Junto con el protocolo de tres moléculas ejemplo, los procesos de adquisición de datos y análisis de datos se describen y se proporcionan referencias para lectura adicional. Los ejemplos de moléculas son: la (lineal) tirosina polímero, el polímero de injerto PI- g-PS y el Papa de los lípidos. Esto incluye ligeras variaciones del protocolo, por ejemplo para unir covalentemente cisteínas. Además, una sección está dedicada a la preparación de diferentes superficies tales como una superficie de diamante, un CH 3 monocapa -placas, montado y bicapas lipídicas. Estas interfaces tienen proven ser buenas referencias y ejemplos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

Espectroscopia de fuerza atómica es una herramienta ideal para estudiar moléculas en superficies e interfaces. Se presenta un protocolo experimental para acoplar una gran variedad de moléculas individuales de forma covalente a una punta de AFM. Al mismo tiempo la punta del AFM se pasiva para evitar interacciones no específicas entre la punta y el sustrato, que es un requisito previo para estudiar moléculas individuales unidos a la punta del AFM. Los análisis para determinar la fuerza de adhesión, la longitud de la adhesión, y la energía libre de estas moléculas en superficies sólidas y bio-interfaces son poco presentaron y se proporcionan referencias externas de lectura adicional. Moléculas ejemplo son los politirosina poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas son desorbidos de diferentes superficies como CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado diamante y apoyaron bicapas lipídicas en diversas condiciones de disolvente. Por último, laventajas de la fuerza espectroscópicas única molécula de experimentos se discuten incluyendo medios para decidir si realmente una sola molécula se ha estudiado en el experimento.

En lo siguiente, los resultados para el ejemplo de arriba describen moléculas, a saber, la politirosina polímeros de poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido, se presentan. En primer lugar para cada ejemplo, experimentar detalles específicos de adquisición de datos y preparación de datos se proporcionan. A continuación, se muestran los resultados ejemplares para experimentos en los que estas moléculas se desorbe de diferentes superficies (CH 3 -SAMs, hidrógeno...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K vistas.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Investigación

Química

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioingeniería

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Bioquímica

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Ingeniería

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

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