Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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Los autores agradecen al Prof. Thomas Reiner, el Dr. Jacob Houghton, y el Dr. Serge Lyaschenko para conversaciones útiles.

Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y con las normas éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. La conjugación de DFO-NCS a J591 <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una solución de 2-5 mg / ml de J591 en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (pH 7,4) o 0,5 M de tampón HEPES (pH 7,4). </li><li> Disolver DFO-NCS en DMSO seco a una concentración entre 5-10 mM (3.8 a 7.6 mg / ml). Someter a ultrasonidos o vórtice bien la solución con el fin de facilitar la disolución completa. </li><li> Ajustar el pH de la solución J591 a 8,8-9,0 mediante la adición de pequeñas alícuotas (&lt;10 l) de 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Una vez que la solución de anticuerpo está en el pH correcto, añadir un volumen de la solución DFO-NCS correspondiente a un exceso molar de 3-4 veces del quelante bifuncional. <ol><li> Por ejemPLE, añadir 4-5 l de un 10 mM (7,6 mg / ml) solución de DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 ml de una solución de anticuerpo J591 2 mg / ml (13,3 nmol J591). La cantidad de DMSO en la mezcla final de reacción acuosa no debe exceder de 2% v / v. </li></ol></li><li> Se incuba la reacción durante 30 min a 37 ° C en un bloque de calentamiento agitando a 350 rpm. </li><li> Después de 1 hora a 37 ° C, purificar el inmunoconjugado resultante usando una columna de desalación exclusión preenvasado desechable con un tamaño de 50.000 de peso molecular de corte usando 0,5 M de tampón HEPES (pH 7,4) como el eluyente. Este paso producir una solución de la construcción J591-DFO completado 2 ml. </li><li> Medir la concentración de la J591-DFO construir en un espectrofotómetro UV-Vis. </li><li> Si se desea una mayor concentración de la construcción, concentrar la solución J591-DFO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. </li><li> Guarde la solución del inmunoconjugado J591-DFO completado a -20 ° C en la oscuridad. </ol> 2. El radiomarcado J591-DFO con 89 Zr PRECAUCIÓN: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos o la realización de cualquier otro trabajo con investigadores de radiactividad debe consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Se deben tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. NOTA: En el interés de radioquímica nota de mantenimiento adecuado, la cantidad de radiactividad en la muestra debe ser medido usando un calibrador de dosis y registrada antes y después de los pasos 2.2 a 2.13 en el protocolo a continuación. Esto le ayudará con la determinación precisa de los rendimientos de radioquímica y actividades específicas. <ol><li> Preparar una solución de 0,5-2,0 mg de J591-DFO en 200 l de 0,5 M de tampón HEPES, pH 7,5. </li><li> Verter un volumen de la &lt;sup&gt; 89 solución Zr 4+ acciones (suministrado normalmente en ácido oxálico 1,0 M) correspondiente a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) en un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de plástico de 2 ml. Ajuste el volumen de esta solución a un total de 300 l usando ácido 1,0 M oxálico. </li><li> Ajustar el pH de la solución de Zr 4+ 89 a 06/08 a 07/05 usando 1,0 M Na 2 CO 3. Comience por la adición de 250 l de 1,0 M Na 2 CO 3 a la solución 89 4+ Zr y, posteriormente, añadir más pequeño (&lt;10 l) alícuotas de la base para conseguir el pH deseado. </li><li> Añadir la cantidad deseada de solución de pH ajustado 89 Zr 4+ a la solución J591-DFO preparado en el Paso 2.1. </li><li> Comprobar el pH de la mezcla de reacción de radiomarcaje para asegurar que cae dentro del intervalo deseado de 06/08 a 07/05. </li><li> Incubar la reacción de radiomarcado durante 60 minutos a RT en un bloque de calentamiento agitando a 350 rpm. </li><li> Después de 60 minutos de incubación, mida la radiolabeling rendimiento de la reacción utilizando la radio-TLC. <ol><li> Para este fin, detectar 1 Ci de la mezcla de reacción de radiomarcaje en una tira de TLC de sílice impregnado. Permitir la alícuota se seque, ejecute el TLC usando un eluyente de DTPA mM (pH 5,5) 50 y analizar la tira TLC usando un escáner de radio-TLC. 89 Zr 4+ unido a la construcción J591-DFO aparecerá en el origen (R f &lt;0,1), mientras que cationes libres 89 Zr 4+ serán quelados con DTPA y eluirán con el frente del disolvente (R f&gt; 0,9). </li><li> Calcular el rendimiento de radiomarcado de la reacción mediante la integración de la radiocromatograma, dividiendo el área bajo la curva de R f 0,0-0,1 por el área total bajo la curva, y multiplicando por 100. </li></ol></li><li> Si el rendimiento de radiomarcado es suficiente (típicamente una actividad específica teórica de&gt; 2 mCi / mg), se extingue la reacción con 5 l de DTPA 50 mM, pH 5,5. </li><li> Se purifica el USI inmunoconjugado resultanteng una columna de desalación de exclusión por tamaño desechable pre-empaquetada con un peso molecular 50.000 de corte usando un eluyente de cualquiera de 0,9% de solución salina estéril con 5 mg / ml de ácido gentísico o acetato de sodio 0,25 M (pH 5,5) con 5 mg de ácido gentísico / ml . Este paso dará lugar a una solución de terminada la radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 2 ml. </li><li> Después de la purificación, verificar la pureza radioquímica del 89 Zr-DFO-J591 uso de la radio-TLC como se describe en el Paso 2.7. </li><li> Calcular el rendimiento global de la reacción de radiomarcaje dividiendo la cantidad de actividad inicialmente añadido a la solución de anticuerpo por la cantidad de radiactividad aislado con el purificada radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591. </li><li> Calcular la actividad específica final dividiendo la cantidad de actividad aislada con el purificada 89 Zr-DFO-J591 radioinmunoconjugado por la masa inicial de DFO-J591 en la reacción de radiomarcado. </li><li> Si se desea una mayor concentración, concentrar ésimoe 89 solución de Zr-DFO-J591 utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. NOTA: El ácido gentísico utilizado en la etapa de purificación final es un protector de radio empleado para minimizar la degradación del anticuerpo debido a la radiolisis 46 Mientras que el almacenamiento de la 89 radioinmunoconjugado Zr-DFO-J591 para un máximo de 48 horas a 4 ° C. es posible, no es recomendable. Si el radioinmunoconjugado se va a almacenar, utilizar 0,25 M de acetato de sodio (pH 5,5) con 5 mg / ml de ácido gentísico como el tampón de almacenamiento con el fin de minimizar el riesgo de radiolisis hipoclorito mediada. 47 </li></ol> 3. En Vivo TEP con 89 Zr-DFO-J591 PRECAUCIÓN: Como en la sección Protocolo 2, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Todo posibse deben tomar medidas le minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En ratones desnudos atímicos macho, implante por vía subcutánea 5 x 10 células de cáncer de próstata LNCaP 6 y permiten éstos crezcan a un xenotrasplante 100-150 mm 3 (3-4 semanas después de la inoculación). 44 </li><li> Diluir el radioinmunoconjugado 89 Zr-DFO-J591 a una concentración de 1,0 mCi / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución 89 Zr-DFO-J591 (200 Ci; 7,4 MBq). En la vena lateral de la cola de los ratones de xenoinjerto-cojinete 48 </li><li> En el punto de tiempo de formación de imágenes deseado (por ejemplo, 12, 24, 48, 72, 96, o 120 horas después de la inyección), anestesiar al ratón con un isoflurano 2%: mezcla de gas de oxígeno. </li><li> Coloque el ratón sobre la cama del pequeño escáner PET animal, y mantener la anestesia durante el análisis utilizando un isoflurano al 1%: mezcla de gas de oxígeno. Antes de colocar el animal en el escáner, verifique la anestesia utilizando el método del dedo del pie-pinch y aplpomada oftálmica y a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia. 49 </li><li> Adquirir los datos de PET para el ratón a través de un análisis estático con un mínimo de 40 millones de eventos coincidentes utilizando una ventana de energía de 350-700 keV y una ventana de tiempo coincidencia de 6 nseg. 50 </li><li> Después de completar la adquisición de la imagen, no deje el ratón sin atención y no lo coloque en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado la conciencia. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien la construcción, radioinmunoconjugados labled-Zr-DFO radiomarcaje, y las imágenes de 89 es generalmente un procedimiento bastante sencillo, es importante mantener algunas consideraciones clave en mente durante cada paso del proceso. Por ejemplo, tal vez la causa más probable de preocupación durante la etapa de conjugación del procedimiento es la agregación del anticuerpo durante la reacción de conjugación. Este problema es más a menudo un producto de mala mezcla de la reacción de conjugació...

Debido a su notable sensibilidad, afinidad y selectividad, los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para el suministro de radioisótopos a las células cancerosas. Sin embargo, su aplicación en la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha visto obstaculizada por la falta de un radioisótopo emisor de positrones adecuados para su etiquetado. 1-3 Una de las consideraciones más importantes en el diseño de radioinmunoconjugados se coincida con el deterioro físico de media la vida del radioisótopo a la farmacocinética in vivo de los anticuerpos. Más específicamente, los anticuerpos a menudo tienen relativamente largos, de varios días biológicos vidas medias y por lo tanto deben ser etiquetados con radioisótopos con vidas medias físicas comparables. Para aplicaciones de imágenes de PET, los anticuerpos han sido tradicionalmente radiomarcado con 64 Cu (t 1/2 = 12,7 horas), 86 Y (t 1/2 = 14,7 horas), o 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 Sin embargo, cada uno deestos radioisótopos posee importantes limitaciones que dificultan su idoneidad para la imagen clínica. Mientras radioinmunoconjugados marcadas con 86 y 64 Y Cu han demostrado ser prometedor en investigaciones preclínicas, ambos isótopos poseen vidas medias físicas que son demasiado cortos para ser eficaz para formación de imágenes en seres humanos. 124 I, en cambio, tiene una vida media física casi ideal para formación de imágenes con anticuerpos, pero es caro y tiene características de desintegración subóptimas que conducen a la resolución relativamente baja imágenes clínicas. Además, 124 radioinmunoconjugados I-marcado puede estar sujeto a deshalogenación in vivo, un proceso que puede reducir razones de actividad tumor a fondo. 6,7 La unidad para encontrar un radioisótopo emisor de positrones para suplantar 64 Cu, 86 Y, y 124 I en radioinmunoconjugados ha alimentado el reciente aumento de la investigación en 89 anticuerpos Zr-etiquetados. 8-12 Tque la razón para el advenimiento de 89 Zr es sencillo: el radiometal posee propiedades físicas y químicas casi ideal y para su uso en radioinmunoconjugados de PET de diagnóstico 13 89 Zr se produce a través de la 89 Y (p, n) 89 reacción Zr en un ciclotrón usando una. comercialmente disponible y 100% naturalmente abundante objetivo 89 Y 14,15. El metal radiactivo tiene un rendimiento de positrones de 23%, se desintegra con una vida media de 78,4 h, y emite positrones con la relativamente baja de energía de 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 Es importante señalar que 89 Zr también emite una alta energía, 909 keV γ-ray con 99% de eficiencia. Mientras que esta emisión no interfiera con energía con las emitidas 511 keV fotones, requiere consideración adicional en relación con el transporte, la manipulación y la dosimetría. A pesar de esta advertencia, estas características de desintegración en última instancia significa que 89 Zr no sólo tiene una h más favorablealf-vida para formación de imágenes con anticuerpos que 86 Y 64 y Cu pero también puede producir imágenes de mayor resolución de 124 I, que emite positrones con mayores energías de 687 y 975 keV, así como un número de fotones con energías dentro de 100-150 keV de los fotones de positrones creado 511 keV. 13 Por otra parte, 89 Zr es también más seguro de manejar, menos caro de producir, y residualizes en los tumores más eficazmente que su homólogo de yodo radioactivo. 18,19 Una limitación potencial de 89 Zr es que no tiene un Isotopólogo terapéutico, por ejemplo, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Esto impide la construcción de agentes de imagen químicamente idénticos, sustitutos que pueden emplearse como exploradores dosimétricos para sus contrapartes terapéuticas. Dicho esto, las investigaciones sugieren que los anticuerpos 89 Zr-etiquetados tienen potencial como sustitutos de imágenes para 90 Y- y 177 inmunoconjugados marcados con Lu.20,21 Desde un punto de vista químico, como un metal del Grupo IV, 89 Zr existe como un catión 4 en solución acuosa. El ion Zr 4+ está altamente cargada, relativamente grande (radio iónico efectivo = 0,84 Å), y puede ser clasificado como un catión &quot;duro&quot;. Como tal, exhibe una preferencia por ligandos que llevan hasta ocho donantes de oxígeno duros, aniónicos. Fácilmente el quelante más común usado en 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr es la deferoxamina (DFO), un sideróforo derivada, quelante acíclico teniendo tres grupos hidroxamato. El ligando coordina de forma estable el catión Zr 4+ rápida y limpia a temperatura ambiente a niveles de pH biológicamente relevantes, y el complejo de Zr-DFO resultante permanece estable durante el curso de varios días en solución salina, suero de la sangre, y la sangre entera. 22 estudios computacionales sugieren fuertemente DFO que forma un complejo con hexacoordinate Zr 4+ en la que el centro metálico se coordina a los tres neutral y tres donantes de oxígeno aniónicos del ligando, así como dos ligandos de agua exógenos (Figura 2). 23,24 El comportamiento in vivo de radioinmunoconjugados que emplean la conjugación de andamio 89 Zr-DFO ha sido en general excelente. Sin embargo, en algunos casos, las imágenes y los estudios de biodistribución agudas han revelado los niveles de actividad elevados en los huesos de los ratones inyectados con 89 anticuerpos Zr-etiquetados, datos que sugiere que la osteophilic 89 Zr 4+ catión se libera de la quelante in vivo y posteriormente mineraliza en el hueso. 25 Recientemente, un número de investigaciones en el desarrollo de nuevos 89 Zr 4+ quelantes particularmente ligandos con ocho donantes de oxígeno han aparecido en la literatura. 24,26,27 Sin embargo, en la actualidad, el DFO es el quelante más ampliamente empleado en 89 radioinmunoconjugados Zr-etiquetados por un amplio margen. Una variedad de diferentesestrategias bioconjugation se han empleado para unir DFO a anticuerpos, incluyendo la química clic bioorthogonal, la reacción del tiol reactiva DFO construye con cisteínas en el anticuerpo, y la reacción del éster activado de soporte de DFO construye con lisinas en el anticuerpo. 4,28- 30 Fácilmente la estrategia más común, sin embargo, ha sido el uso de un derivado de isotiocianato de soporte de DFO, DFO-NCS (Figura 2). 22 Este quelante bifuncional disponible comercialmente robusta y fiable forma, vínculos tiourea covalentes estables con las lisinas de la anticuerpo (Figura 3). En los últimos años, una amplia variedad de 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr-DFO han sido reportados en la literatura. Investigaciones preclínicos han sido especialmente abundantes, con anticuerpos que van desde la más conocida el cetuximab, bevacizumab y trastuzumab a anticuerpos más esotéricos como el CD105 de metas de TRC105 y fPSA de metas 5A10. 30-36 Más recientemente, un pequeño número de ensayos clínicos de fase temprana utilizando anticuerpos marcados 89-Zr-DFO han surgido en la literatura. Ensayos Específicamente, los grupos en los Países Bajos han publicado que emplean 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, y 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Además, una serie de otros ensayos clínicos con 89 radioinmunoconjugados marcados con Zr están actualmente en curso, incluidas las investigaciones aquí en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering utilizando el PSMA de metas de 89 Zr-DFO-J591 por imagen del cáncer de próstata y el 89 Zr-DFO-trastuzumab HER2-dirigido por imagen del cáncer de mama. 23, 30 Además, mientras que los anticuerpos radiomarcados siguen siendo los 89 radiofármacos marcados con Zr más comunes, el metal radiactivo ha sido empleado también cada vez más con otros vectores, incluyendo péptidos, proteínas, y los nanomateriales. 38-43 </sup&gt; La modularidad de este 89 metodología etiquetado Zr-DFO es un enorme activo. El repertorio de anticuerpos de biomarcadores de metas es cada vez mayor, y el interés en la realización de la PET vivo utilizando estas construcciones está creciendo a buen ritmo. Como resultado, creemos que el desarrollo de las prácticas y protocolos más estandarizados podría beneficiar el campo. Una excelente protocolo experimental escrito para DFO-NCS conjugación y 89 Zr radiomarcaje ya ha sido publicada por Vosjan, et al. 22 Creemos que la demostración visual proporcionada por este trabajo podría ayudar aún más a los investigadores nuevos a estas técnicas. En el protocolo a mano, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de la 89 radioinmunoconjugado Zr-DFO-MAB,y (3) in vivo de formación de imágenes PET con una Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado 89 en un modelo murino de cáncer. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

La excepcional afinidad, especificidad y selectividad de los anticuerpos a tomar vectores extraordinariamente atractivos para radiofármacos PET-tumorales objetivo. Debido a su vida media biológica de varios días, los anticuerpos deben estar etiquetados con radionucleidos emisores de positrones con relativamente largos de decaimiento físico vidas medias. Tradicionalmente, los isótopos emisores de positrones 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h), y 64 Cu (t 1/2 = 12,7 hr) se han utilizado para marcar anticuerpos para imágenes PET. Más recientemente, sin embargo, el campo ha sido testigo de un aumento dramático en el uso del metal radiactivo emisor de positrones 89 Zr en agentes formadores de imágenes de PET basadas en anticuerpos. 89 Zr es un radioisótopo casi ideal para la formación de imágenes PET con inmunoconjugados, ya que posee un medio físico -La vida (t 1/2 = 78,4 hr) que es compatible con la farmacocinética in vivo de anticuerpos y emite un relativamente bajo enopositrones rgy que produce imágenes de alta resolución. Además, los anticuerpos pueden ser francamente etiquetados con 89 Zr usando el quelante de deferoxamina sideróforo derivada (DFO). En este protocolo, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de un 89 Zr radioinmunoconjugado DFO-mAb, y (3) en vivo de imágenes PET con un 89 Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado en un modelo murino de cáncer.

El primer paso en este protocolo la conjugación de DFO-NCS al anticuerpo es típicamente bastante robusto y fiable. Generalmente, la, inmunoconjugado modificado quelante-purificado puede obtenerse con un rendimiento&gt; 90%, y el uso de 3 equivalentes molares de DFO-NCS en la reacción inicial Conjugación producirá un grado de etiquetado del quelante de aproximadamente 1,0-1,5 DFO / MAB. Los 89 Zr de radiomarcaje y purificación pasos del procedimiento son igualmente sencillo. A las concentraciones descrit...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

El bioconjugación y Radiosíntesis de<sup&gt; 89</sup&gt; Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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17.1K vistas.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Un protocolo optimizado para el radiomarcaje eficaz de nanopartículas de oro mediante el uso de una<sup&gt; 125</sup&gt; Azida grupo prostético marcado con I

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Investigación

Química

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparación y Evaluación de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Bioingeniería

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

Tomografía por emisión de positrones Imágenes del tráfico celular: un método de radiomarcaje celular

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Investigación sobre el cáncer

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Inmunología e Infección

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

Determinación de la afinidad de unión (KD) de anticuerpos radiomarcados a antígenos inmovilizados

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Medicina

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Radioinmunoterapia predirigida: un método para la administración dirigida de radionúclidos terapéuticos a los tumores

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
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El bioconjugación y Radiosíntesis de

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Un protocolo optimizado para el radiomarcaje eficaz de nanopartículas de oro mediante el uso de una

Preparación y Evaluación de