Este trabajo es apoyado por Alex Limonada Foundation (LMD), la Sociedad Americana del Cáncer (LMD), el MGH Howard Goodman Fellowship (LMD), y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R24OD016761 y 1R01CA154923 (DML). CNY Citometría de Flujo y Análisis de Flujo de imagen, instrumentación compartida número de concesión 1S10RR023440-01A1. IMT es financiado por una beca de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (Fundação para a Ciência e Tecnologia - FCT). QT es financiado por el Consejo de Becas de China. Damos las gracias a Angela Volorio por sus valiosos comentarios y consejos.

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Hospital General de Massachusetts Subcomité de Investigación Animal Care, bajo protocolo # 2011N000127. Sección 1. músculo esquelético Trasplante de células en rag2 Adulto E450fs Homocigótica pez cebra mutante 1. Preparación de adultos de pez cebra donantes células del músculo esquelético <ol><li> Obtener adultos de pez cebra transgénico que han marcado con fluorescencia muscular. En este experimento, 30 α-actina de pescado donante-RFP 25 se utilizaron para trasplantar 1 x 10 6 células por pez destinatario. </li><li> Sacrificio de pez cebra de donantes en 1,6 mg / ml tricaína metanosulfonato (MS222) durante 10 min o hasta que no hay movimiento opérculo es evidente. </li><li> Coloque el pescado donante en una toalla de papel absorbente y los impuestos especiales del músculo dorsal usando una hoja de afeitar limpia. El corte debe hacerse cerca del ano en un ángulo de 45 ° para maximizar la recogida de tejidos (como se indica en la Figura 1A </strong&gt;). Coloque el tejido diseccionado en un lugar limpio 10 cm placa de Petri. </li><li> Añadir 500 l tampón de suspensión (0.9x pre-enfriada de tampón fosfato salino (PBS) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS)) para el tejido diseccionado. Hasta el 10 de pez cebra donante se pueden colocar juntos en este volumen. </li><li> Picar el tejido con una cuchilla de afeitar&gt; 20 veces hasta que las células están en una suspensión uniforme. La musculatura dorsal entero se homogeneiza incluyendo la piel, los huesos y las aletas. Añadir 2 ml de tampón de suspensión. Usando una pipeta de 5 ml, se tritura la suspensión celular ≥20 veces para disociar las células. </li><li> Se filtra la suspensión celular a través de un colador de malla 40 micras en un tubo cónico de 50 ml se colocó en hielo. </li><li> Lavar la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón de suspensión para recoger el tejido restante y filtrar a través de la misma filtro y tubo cónico, a un volumen final de 5 ml (10 peces donante puede ser utilizado por aislamiento). NOTA: la piel, los huesos y aletas serán excluidos después de la filtración. </li&gt; <li> Si procede, se combinan suspensiones similares en el mismo tubo cónico. </li><li> Cuente el número total de células viables utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li><li> Reserva 500 l para citometría de flujo, si se desea (opcional, paso 2). </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 1000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Deseche las células sobrenadante y resuspender en 3,33 x 10 5 células / l (0.9x PBS + 5% FBS). En total, 3 l se inyectará por pez destinatario para un total de 1 x 10 6 células por destinatario (paso 3). NOTA: Menos de 3 l de suspensión celular deben ser trasplantados a los peces receptor. Si el número de células es limitante, tan bajos como 5 x 10 4 células por beneficiario puede llevar a éxito del injerto (Tabla 1). </li></ol> 2. Análisis de citometría de flujo de Donantes del esqueleto de la célula muscular Preparación (Opcional) <ol><li> Aislar muscular de un tipo salvaje, pescado no transgénica como se indica in paso 1.1. Esta muestra sirve como el control negativo y es útil para configurar puertas citometría de flujo. </li><li> Añadir un colorante de viabilidad apropiado. Por ejemplo, añadir 5 l de solución de DAPI (500 ng / l) a 500 l de preparación muscular. Vortex ligeramente antes del análisis. Adquirir 5 x 10 03 al 01 x 10 4 eventos. Analizar las muestras de control de tipo salvaje primero para colocar puertas seguido por análisis de las células musculares aisladas de peces transgénicos. NOTA: citometría de flujo análisis se realiza generalmente dentro de 1 hora después de la disección del tejido muscular, tiempo durante el cual las células disecadas retienen más de 60% ​​de viabilidad (Figura 2). Las células deben mantenerse en hielo en todo momento. La viabilidad celular total puede ser re-evaluado antes del trasplante utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li></ol> 3. intramuscular El trasplante de células del músculo esquelético en rag2 Adulto Homocigótica pez cebra mutante <ol><li> Limpie a 10 μ; L 26S G micro-jeringa por el dibujo en y expulsar solución de lejía al 10% (5 veces), seguido por etanol al 70% (5 veces), y luego seguido por tampón de suspensión (0.9x PBS + 5% FBS, 10 veces). </li><li> Anestesiar 2-4 meses de edad homocigotos peces mutantes rag2 o pescado tipo de destinatario salvaje (como controles) añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222, 4 mg / ml solución madre) en una placa de Petri que contiene el pez en el agua del sistema hasta que los movimientos lentos opérculo y el pescado son todavía. NOTA: Dosis de la anestesia tricaína dependerá de la edad y tamaño del pez cebra destinatario. </li><li> Coloque el pez cebra destinatario anestesiado sobre una toalla de papel húmedo o una esponja, con el lado izquierdo hacia arriba. </li><li> Insertar la aguja de la jeringa en la musculatura latero-dorsal (refiérase a la Figura 1A). Asegúrese de que las inyecciones se realizan en un ángulo de 45 °. Inyectar 3 l de la suspensión celular (preparado en la etapa 1.12) por pez para un total de 1 x 10 6 células por receptor.</li><li> Transferir cuidadosamente el pez cebra se inyecta en un tanque limpio usando una cuchara de plástico para recuperarse. </li><li> Evaluar el pez cebra destinatario para las tasas de injerto a los 10, 20, 30 días después del trasplante por imágenes peces anestesiados bajo campo claro y microscopía de epifluorescencia. </li></ol> Sección 2. Rabdomiosarcoma embrionario (SGDEA) Trasplante en adultos Homocigótica rag2 pez cebra mutante 4. ADN microinyección de embriones de pez cebra <ol><li> Linealizar el plásmido rag2-kRASG12D 7 digiriendo 10 g de ADN con XhoI, a 37 ° C durante 6 horas o O / N. </li><li> Se purifica el ADN con fenol estándar: extracción con cloroformo y precipitar con etanol. Resuspender en 20 l de agua desionizada (alternativamente, columnas de purificación de fragmentos de ADN comerciales pueden ser utilizados). </li><li> Ejecutar el ADN no digerido y digerido en un gel de agarosa al 1% y determinar la concentración de ADN bespectrómetro de lectura y. Alternativamente, ejecute muestras a 1: 1, 1: 5, 01:10 y diluciones en un gel de agarosa al 1% y cuantificar en comparación con una escalera de ADN. </li><li> Preparar una mezcla de inyección a una concentración final de 15 ng / l de ADN rag2-kRASG12D digerido en 0.1 M KCl y 0,5x Tris-EDTA. La cantidad final de ADN se inyecta en 2 nl de volumen de inyección será 30 pg. NOTA: Hasta tres construcciones de ADN diferentes pueden ser eficientemente co-inyectados en un máximo de 60 pg de ADN por embrión. Estos transgenes se integran en el genoma y co-expresados ​​en el tumor en desarrollo 26. </li><li> Inyectar linealizado rag2-kRASG12D en embriones etapa de células esencialmente como se describe 27 en una cepa de pez cebra de interés (Figura 1B). Las inyecciones se deben realizar en la célula y no en la yema de huevo para una mayor eficiencia. En este experimento, un transgénico AB-doble cepa; myf5-GFP, se utilizó mylpfa-mCherry. Levante pez cebra mediante la cría estándar protocols 28. NOTA: la supervivencia de inyección es a menudo depende de la cepa utilizada pez cebra. En promedio, 30% de los embriones inyectados desarrollará SGDEA. 300-600 embriones deben ser inyectados por experimento con el fin de garantizar que los tumores primarios suficientes GFP-positivas y mCherry-positivos se generan para el trasplante y el análisis. </li></ol> 5. Detección del SGDEA primarias en pez cebra larvas <ol><li> Observe el pez cebra inyectado desde 10 a 30 días después de la inyección para el surgimiento de SGDEA primarias visibles externamente. </li><li> A los 30 días después de la inyección, anestesiar pez cebra destinatario añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222 4 mg solución / ml) en una placa de Petri que contiene agua del sistema pescado hasta movimientos opérculo lento y el pescado son todavía. NOTA: Dosis de la anestesia tricaína dependerá de la edad y tamaño del pez cebra destinatario. Pez cebra con tumores primarios requieren dosis más bajas de tricaína. </li><li> Seleccione SGDEA portadora primariapeces que son myf5-GFP -positivo y mylpfa-mCherry -positivo, utilizando un microscopio de epifluorescencia. </li></ol> 6. SGDEA Tumor Preparación <ol><li> Sacrificar el pez cebra SGDEA-cojinete primaria seleccionada en 1,6 mg / ml tricaína metanosulfonato (MS222) durante 10 min o hasta que no hay movimiento opérculo es evidente. </li><li> Procesar cada pez cebra portadores de tumor por separado. Coloque el pescado en un plato de Petri limpia y diseccionar alrededor del tumor utilizando una hoja de afeitar y unas pinzas finas (como se muestra en la Figura 1B). Transferir el tejido tumoral diseccionado a una placa de Petri limpia. </li><li> Añadir 100 l de 0.9x pre-enfriada de tampón fosfato salino (PBS) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS). Tejido Pique con una hoja de afeitar limpia&gt; 20 veces hasta que las células se encuentran en una suspensión uniforme. </li><li> Añadir 900 l de la misma solución tampón (0.9x PBS + 5% FBS), pipeta hacia arriba y abajo varias veces para disociar las células utilizando un 1000 l filtrados punta de la pipeta. Filtrar con un 40 &amp;# 956; m colador de malla en el tubo cónico de 50 ml correspondiente. Almacenar en hielo. </li><li> Lavar la placa de Petri con un adicional de 2-4 ml de tampón, y pasar a través del mismo filtro de malla y dentro del tubo cónico correspondiente. </li><li> Centrifugar a 1000 xg, durante 10 min, a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender en 100 l de tampón. </li><li> Cuente el número total de células viables utilizando colorante azul de tripano y un hemocitómetro. </li><li> Diluir las células a la concentración deseada en el mismo tampón (0.9x PBS + 5% FBS). Las células deben diluirse a 5 x 10 3 células / l para el trasplante 5 l por pez cebra destinatario en un total de 2,5 x 10 4 células por destinatario. </li><li> Análisis de citometría de flujo también se puede realizar con una pequeña cantidad de la suspensión de la etapa 6.5 para cuantificar las proporciones relativas de células fluorescentes en la muestra. NOTA: Dejar de lado 100 l de suspensión celular (después de filtración en el paso 3.5) y diluir con 400 lde 0.9x PBS + 5% FBS tampón de suspensión para el análisis de citometría de flujo. Para asegurar la selección adecuada, realizar análisis adicionales utilizando tejido tumoral transgénico sola o músculo aislado de tipo salvaje adulto, myf5-GFP y pescado mylpfa-mCherry. Realizar Citometría de Flujo esencialmente como se describe en el paso 2 de la sección 1. </li></ol> 7. El trasplante de SGDEA en adultos rag2 Homocigótica pez cebra mutante <ol><li> Limpiar a 10 l 26S G micro-jeringa por el dibujo en y expulsar 10% de solución de lejía (5 veces), seguido por etanol al 70% (5 veces), y luego seguido por tampón de suspensión (0.9x PBS + 5% FBS, 10 veces ). </li><li> Anestesiar destinatario homocigotos peces mutantes rag2 añadiendo gotas individuales de metanosulfonato tricaína (MS222 4 mg solución madre / ml) en una placa de Petri que contiene el pez en el agua del sistema hasta los movimientos opérculo son lentos y el pescado son todavía. </li><li> Coloque el pez cebra destinatario anestesiado sobre una toalla de papel húmeda o spoENS, con la parte ventral hacia arriba. </li><li> Inyectar 5 l de la suspensión celular en la cavidad peritoneal (2,5 x 10 4 células por recipiente). NOTA: La aguja de inyección se debe limpiar entre las inyecciones de diferentes tumores como se describe en el paso 4.1. 5 a 10 l pueden ser trasplantados de manera eficiente por vía intraperitoneal, dependiendo de receptor tamaño del pescado. El injerto del tumor se puede lograr mediante la inyección de 1 x 04 al 05 octubre x 10 5 células no clasificadas por pez receptor (Tabla 1). </li><li> Con cuidado, coloque el pez cebra destinatario en un tanque limpio con una cuchara de plástico. </li><li> Evaluar el pez cebra destinatario para las tasas de injerto a los 10, 20, 30 días después del trasplante por imágenes peces anestesiados bajo campo claro y microscopía de epifluorescencia. </li><li> Utilizar peces implantada para aplicaciones posteriores, incluyendo clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para evaluar el estado de diferenciación (Figura 3H), Analy histológico estándarsis (Figura 3F), las respuestas de terapia de imagen 15, y / o trasplante de serie enfoques incluyendo análisis de dilución limitante 11. </li></ol>

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A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analysis+of+adult+zebrafish+cells+enriched+for+skeletal+muscle+progenitors).">Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors).</a> Muscl, &amp; nerve. 43 (5), 741-750 (2011).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).</li><li>Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesoangioblast-like+myogenic+progenitors+in+mouse+models+of+muscle+regeneration.">Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration.</a> J Vis Exp. (83), e50532 (2014).</li><li>Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myogenic+precursor+cell+that+could+contribute+to+regeneration+in+zebrafish+and+its+similarity+to+the+satellite+cell.">A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell.</a> The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).</li><li>Rowlerson, a., Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+skeletal+muscle+in+two+teleost+fish:+Sparus+aurata+and+Brachydanio+rerio.">Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio.</a> Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).</li><li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Injerto eficiente y robusto del músculo esquelético dorsal adulta se alcanza con un método muy simple preparación de células seguido de la inyección de las células en la musculatura dorsal de rag2 peces mutantes homocigotos. En general, los procedimientos de inyección intramuscular fueron muy robusto, con un poco de muerte asociado inmediatamente después del procedimiento de implantación, que van desde 10% a 35% dependiendo del experimento. Optimización adicional que se centrará en la utilización de agujas de calibre más pequeños para inyección y desarrollo de aparato de inyección estacionario utilizando un microscopio y micromanipulador, lo que facilitará la facilidad de la implantación de células. Nuestro enfoque también utiliza células musculares sin ordenar de animales donantes y sólo contenía aproximadamente 30% de células progenitoras de músculo. El uso de líneas transgénicas reportero que etiquetan las células madre y el aislamiento FACS probablemente proporcionar suspensiones de células enriquecidas que conducen a un aumento de injerto en peces destinatario. Esquelético muscular cells también podría ser enriquecido y se cultivaron antes del trasplante, como se describió anteriormente 29. Sorprendentemente, nuestros resultados también indican que las etapas de establecimiento de nicho y la diferenciación del tejido muscular de los donantes se producen antes de 10 días después del trasplante, el establecimiento de este modelo como una plataforma experimental robusto y rápido para evaluar el injerto y la regeneración muscular. Por otra parte, estos experimentos contrastan fuertemente con las realizadas en ratones, donde se requiere antes de la lesión del músculo con cardiotoxina o bario cloruro de dos días antes del injerto 30,31. Es probable que el daño de la aguja producida durante el procedimiento de trasplante potencia el injerto mediante la estimulación de la producción de un entorno regenerativo en el animal receptor 32,33. También Prevemos que nuestro método se adapta fácilmente a el trasplante de tejido de músculo esquelético de pez cebra más joven, lo que permite la evaluación de mutaciones genéticas que afectan al desarrollo del músculo esquelético tempranopero llevar a la letalidad a los estadios larvarios. También hemos proporcionado un protocolo detallado para el injerto de SGDEA pez cebra mediante inyección intraperitoneal en, rag2 peces mutantes no condicionado homocigotos. Este enfoque era útil para la expansión de los tumores primarios transgénicos dobles sin la necesidad de generar tumores dentro de una línea transgénica singénico. Nuestro trabajo reciente ha demostrado que los enfoques de trasplante de células proporcionan nuevos modelos experimentales para evaluar la sensibilidad de drogas SGDEA in vivo, donde un solo tumor se puede ampliar en miles de animales y evaluado por sus efectos sobre el crecimiento, la auto-renovación, y neovascularización 15. Además, hemos incorporado con éxito una amplia gama de tumores en rag2 peces mutantes homocigotos incluyendo células T leucemia linfoblástica aguda, el melanoma y SGDEA 23. Mirando hacia el futuro, prevemos estas líneas serán de utilidad para la evaluación de las propiedades funcionales importantes de cáncer envivo incluyendo la evaluación de la heterogeneidad intra-tumoral, invasión, metástasis, angiogénesis, y resistencia a la terapia. Por otra parte, la generación de rag2 homocigoto mutante de pescado en el ópticamente transparente Casper pez cebra cepa 34 probable facilitará formación directa de imágenes de muchas de estas características del cáncer. En total, ofrecemos protocolos detallados para el éxito del injerto de músculo esquelético marcado con fluorescencia normal y maligno en a rag2 adultos homocigotos inmune pez cebra mutante comprometido.

El pez cebra son un excelente modelo para estudios de regeneración, ya que pueden regenerar aletas amputados, así como un cerebro dañado, retina, médula espinal, corazón, músculo esquelético y otros tejidos 1. De células madre y regenerativas estudios en adultos de pez cebra se han centrado en gran medida en la caracterización de la regeneración en respuesta a una lesión, mientras que la identificación de las células madre y progenitoras de diversos tejidos de trasplante de células sólo recientemente se ha explorado 2. El pez cebra también se han convertido en cada vez más utilizado para el estudio del cáncer a través de la generación de modelos de cáncer de transgénicos que imitan la enfermedad humana 3-10. En el caso del cáncer, los enfoques de trasplante de células se han vuelto ampliamente adoptado y permitir la evaluación dinámica de los procesos de cáncer importantes, incluyendo la auto-renovación 11, la heterogeneidad funcional 12,13, neovascularización 14, la proliferación,respuestas de terapia 15, y la invasión 16,17. Sin embargo, las células injertadas a menudo son rechazadas de peces receptores debido a la acogida defensas inmunitarias que atacan y matan el injerto 18. Varios métodos se han utilizado para superar el rechazo de las células injertadas. Por ejemplo, los animales receptores del sistema inmune pueden ser transitoriamente ablación por una baja dosis de irradiación gamma antes del trasplante 18,19. Sin embargo, el sistema inmune del destinatario se recuperará por 20 días después de la irradiación y matar a las células del donante 18. Alternativamente, el tratamiento de dexametasona se ha utilizado para suprimir la función de las células T y B, proporcionando más tiempo de supresión inmune acondicionado y facilitar el injerto de una amplia gama de tumores humanos de hasta 30 días 14. Estos experimentos requieren la dosificación del fármaco constante y se limitan al estudio de los tumores sólidos. Ensayos de injerto a largo plazo han utilizado líneas singénicas genéticamente idénticos 20 a 22, en donde el donante y recipicélulas tes son inmunes emparejado. Sin embargo, estos modelos requieren líneas transgénicas de interés que se cruzaron en el fondo singénica durante más de cuatro generaciones para producir líneas totalmente singénicas. Para obviar los problemas de rechazo inmunológico en los peces receptor, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un comprometida rag2 E450fs homocigotos mutantes de línea (ZFIN designación alelo rag2 FB101) que han reducido la función de células T y B y que permiten el injerto de una amplia gama de tejidos 23 inmunológico. Modelos de ratón inmunocomprometidos similares se han utilizado ampliamente para el trasplante de células de ratón y de 24 tejidos humanos. Aquí, se presentan métodos para el trasplante del músculo esquelético y rabdomiosarcoma embrionario (ERMS), un sarcoma pediátrico que comparte características con el músculo esquelético, en el rag2 recién descrito homocigotos pez cebra mutante. La disponibilidad de un pez cebra adultos inmune comprometidoamplía nuestra capacidad para llevar a cabo estudios de trasplante de células a gran escala para visualizar directamente y evaluar células madre auto-renovación dentro de los tejidos normales y malignos. Con este método, la etiqueta fluorescente preparaciones de células del músculo adulto de α-actina-RFP 25 pez cebra transgénico injertar robustamente en rag2 pez cebra mutante homocigótica después de la inyección en la musculatura dorsal. Por otra parte, se demuestra el injerto y la expansión de GFP myf5 primaria; mylpfa- mCherry SGDEA transgénicos después de la inyección intraperitoneal en rag2 E450fs homocigotos pez cebra mutante. La utilidad de estos protocolos va más allá de los ejemplos que se muestran y se puede aplicar fácilmente a los tejidos regenerativos de pez cebra adicionales y cánceres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution 1x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93283-100ML</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Science Education</td>
			<td>S77375-1</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>microinjection. Plasmid linearization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104 (50) or 28106 (250)</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1753I-100</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose, 500 g</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI(4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>flow cytometry/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>flow cytometry collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-01</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td>
			<td>Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Bench Underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td>Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singe Edge Industrial Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon-Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430828</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Set&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 &#181;L, needle size 26s ga (bevel tip)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80366</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Austin&#39;s A-1 Bleach, Commercial</td>
			<td>James Austin Company</td>
			<td></td>
			<td>Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C0265-24</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004539&#160;</td>
			<td>Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml serological pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357529</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Plus Pipetting Controller</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4090</td>
			<td>Transportation. Any automatic pipetting controller can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder free examination gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter pipet tips and micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11205-20</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP72 microscope digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish

El pez cebra se han convertido en una herramienta poderosa para evaluar el desarrollo, la regeneración, y el cáncer. Más recientemente, los protocolos de trasplante de células de aloinjerto se han desarrollado que el injerto permiso de células normales y malignas en irradiado, singénico, y adultos de pez cebra inmune comprometido. Estos modelos cuando junto con los protocolos de trasplante de células optimizados permiten la rápida evaluación de la función de células madre, la regeneración después de una lesión, y el cáncer. A continuación, presentamos un método para el trasplante de células de pez cebra adultos músculo esquelético y rabdomiosarcoma embrionario (SGDEA), un sarcoma pediátrico que comparte características con el músculo embrionario, en inmunológico comprometido adulto rag2 E450fs homocigotos pez cebra mutante. Es importante destacar que estos animales carecen de células T y han reducido la función de células B, facilitar el injerto de una amplia gama de tejidos de animales donantes no relacionados. Nuestros protocolos optimizados muestran que marcaron fluorescentemente prepar célula muscularciones de pez cebra transgénico α-actina-RFP injertan robusta cuando se implanta en la musculatura dorsal de rag2 peces mutantes homocigotos. También demostramos injerto de SGDEA fluorescentes transgénico donde la fluorescencia se limita a las células basadas en el estado de diferenciación. Específicamente, SGDEA se crearon en AB-deformación myf5-GFP; mylpfa-mCherry animales transgénicos dobles y tumores inyectados en el peritoneo de peces adultos inmune comprometido. La utilidad de estos protocolos se extiende a injerto de una amplia gama de células normales y malignas donantes que se puede implantar en la musculatura dorsal o el peritoneo de adultos de pez cebra.

Un procedimiento para la preparación y el trasplante de células del músculo esquelético de los donantes transgénicos α-actina-RFP en inmunológico comprometido homocigotos pez cebra mutante rag2 se ha demostrado (sección Protocolo 1, la Figura 1A y Figura 2). Tejido muscular esquelético se preparó a partir donantes transgénicas α-actina-RFP y la suspensión de una sola célula resultante contenía 84,3% de células viables como se evaluó mediante exclusión DAPI siguiente análisis de citometría de flujo (Figura 2B). RFP-células positivas comprendían 35,3% de esta suspensión de células individuales (Figura 2C). El trasplante de células en el músculo esquelético dorsal de rag2 peces receptores homocigotos mutantes llevó al injerto consistente y fuerte según la evaluación de la diferenciación de las células individuales en fibras multinucleadas (1 x 10 6 células inyectadas por pez, Tabla 1, Figura 2D-I). Wild tipobeneficiario los peces no se injertan las fibras musculares durante el experimento de 30 días (n = 13). A los 10 días después del trasplante, 9 de cada 14 rag2 homocigotos pez cebra mutante contenía fibras musculares RFP-positivo cerca del sitio de la inyección (64,3%, Figura 2E, F). Es importante destacar que, músculo RFP-positivo injertado persistió a 30 días post-trasplante (Figura 2G-I), con un subconjunto de animales que se seguido por 115 días post-injerto y exhibiendo el injerto muscular robusto y persistente (datos no mostrados). Estos resultados son similares a los reportados previamente por nuestro grupo 23 utilizando el mismo protocolo (Tabla 1). También hemos presentado un método para la generación, la preparación y el trasplante de células tumorales SGDEA en la cavidad peritoneal de los peces receptor rag2 homocigotos mutantes (Sección Protocolo 2, Figura 1B y la Figura 3). SGDEA se generaron en double transgénico myf5-GFP; pescado mylpfa-mCherry que se han mostrado para permitir la visualización de la heterogeneidad intra-tumoral y el análisis funcional de las subpoblaciones de células tumorales después del trasplante 11. Sin embargo, una mayor caracterización molecular de cada subpoblación es difícil porque los peces son pequeños cuando se desarrollan SGDEA entre 10 a 30 días de vida y el número de células tumorales son limitante para aplicaciones posteriores. Una solución es ampliar el número de células tumorales injertando SGDEA en pez cebra receptor adulto. Hasta la fecha, los experimentos similares se han completado usando CG1-deformación peces singénico y requerida en exceso de 4 generaciones de retrocruzamiento para desarrollar líneas singénicos que eran transgénicos para myf5-GFP; mylpfa-mCherry. Para evitar estos problemas, hemos demostrado la utilidad de rag2 comprometida homocigotos pez cebra receptor mutante inmune a injertarse SGDEA primarias de un pez cebra AB-deformación. Todos SGDEA primarios injertados en rag2 animales mutantes homocigotos, lo que facilita la expansión del tumor (Tabla 1). Resultados similares fueron reportados recientemente donde 24 de 27 rag2 pez cebra mutante homocigotos SGDEA injertadas, mientras que 0 de 7 hermanos de tipo salvaje injertados enfermedad 23. Un ejemplo representativo de un SGDEA injertado se muestra a los 30 días post-trasplante en la figura 3E. Injertadas SGDEA comparten características histológicas de rabdomiosarcoma embrionario, similar a la encontrada en el tumor primario (Figura 3B y 3F). FACS análisis confirmó que SGDEA contenían funcionalmente tumor distinto propagar células y las células diferenciadas que expresan myf5-GFP y / o mylpfa-mCherry. Las tasas de supervivencia tras el procedimiento de inyección intraperitoneal fueron más de 95%. Pez cebra destinatario comúnmente sucumben de carga tumoral después del punto 30 días el tiempo post-trasplante. Figura 1. Protocolo esquemático para (A) normal y (B) maligno esquelético trasplante de células del músculo en rag2 mutante homocigoto el pez cebra. Los pasos opcionales están marcados con (*). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. injerto muscular esquelético en rag2 homocigotos pez cebra mutante. (A) transgénico pez cebra donante α-actina-RFP. (B) La viabilidad celular de aislados de la suspensión de células de músculo evaluada por exclusión de colorante DAPI y citometría de flujo. (C) Proporción de células RFP-positiva se encuentran dentro de la suspensión de células de músculo desde el donante α-actina-RFP (rojo), en comparación con un control de tipo salvaje(Gris). (DE) Fusionada campo brillante y las imágenes fluorescentes de animales salvajes de tipo (D) o rag2 peces mutantes homocigotos (E) a los 30 días post-trasplante. tarifas (F) el injerto en el tiempo. Red denota número de animales injertados mientras gris muestra peces no injertado. Número de animales analizados en cada punto de tiempo se indican. (GI) Imágenes de magnificación de alta de la región de caja en el panel E se muestran a 10 (G), 20 (H) y 30 (I) días post-trasplante, que muestra la retención de las fibras musculares diferenciadas en el tiempo (puntas de flecha). Las barras de escala son iguales a 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" /> Figura 3. Trasplante de myf5-GFP; mylpfa-mCherry SGDEA en homocigotos mutantes rag2 . pez cebra (AD) rag2-kRASG12D SGDEA primarias inducidas surgen en AB-deformación myf5-GFP; pez cebra mylpfa-mCherry a los 30 días de vida. (EH) rag2 homocigotos pez cebra mutante injertado con SGDEA y analizados a los 30 días post-trasplante. (A, E) Fusionada campo brillante y las imágenes fluorescentes de SGDEA primarias y trasplantados. El área tumoral se describe y punta de flecha indica el sitio de inyección en E. (B, F) hematoxilina y eosina secciones de parafina de teñido primario (B) y SGDEA injertadas (F) muestra las zonas de aumento de celularidad asociado con el cáncer. (C,G) La viabilidad celular, evaluada por exclusión de colorante DAPI y citometría de flujo. (D, H) subpoblaciones de células tumorales fluorescentes, según lo evaluado por citometría de flujo. Las barras de escala son iguales a 2 mm (A, E) y 50 m (B, F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" /> Tabla 1. Resultados de injerto para el músculo y el trasplante de células SGDEA. (*) Indica los datos reportados previamente usando las mismas técnicas 23. Los datos se reimprime con permiso de Nature Methods. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla</a>.

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Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

normal-malignant-muscle-cell-transplantation-into-immune-compromised

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K vistas.  Massachusetts General Hospital. Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells. 

Video: Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Intubación por vía oral de pez cebra adulto: un modelo para evaluar la absorción Intestinal de compuestos bioactivos

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...