This work was funded by Genome BC, Genome Canada, and Coastal Genomics. The authors thank Kirby Cronin and Michael Chan for their help in sample collection and processing. We also would like to acknowledge Thea Van Rossum and Dr. Fiona Brinkman for bioinformatics assistance.

1. Recolección de Agua y Filtración <ol><li> Recoger muestras de agua dulce de varios sitios (Figura 1). Pase muestras a través de una serie de filtros: 1 micras filtro, filtro de 0,2 micras, y 30 kDa de corte del filtro de flujo tangencial a sistemáticamente eucariota separado, partículas de tamaño bacterianas y virales, respectivamente. Nota: Sólo la purificación y análisis del material recuperado en las 0,2 micras filtros (bacterias de vida libre) se describe en este informe, pero enfoques similares se puede utilizar para las otras partículas recuperadas de los filtros. </li></ol> 2. Concentración bacteriana, ADN Extracción y Purificación <ol><li> Retire el filtro de membrana de 0,2 micras (s) del sistema de filtración de agua (diagrama esquemático, figura 2). Doble el filtro de 0,2 micras disco en medio y lo coloca en un tubo de 50 ml con el lado abierto hacia arriba. Añadir 5 ml de solución tamponada con fosfato (PBS 1x) y 0,01% de Tween, pH 7,4 enel tubo. Si se utiliza más de un filtro durante el proceso de emplear un tubo diferente por filtro. Tubo (s) tienda con filtro a 4 ° C hasta su transformación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2. </li><li> Retire el filtro de 0,2 micras membrana desde el tubo de 50 ml con una pinza estéril. Place filtro (s) en una placa de Petri (dejar el tampón PBS en el tubo). <ol><li> Con pinzas estériles y tijeras estériles, cortar el filtro en tiras pequeñas (1 cm x 1 cm). Desinfectar pinzas y tijeras por inmersión en el 70% de isopropanol, limpiando con un descontaminante superficie ADN y enjuagar con agua ultrapura de tipo 1 entre las diferentes muestras. </li></ol></li><li> Coloque el filtro de corte en tiras de nuevo en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 10 ml de 1x PBS y 0,01% de Tween, pH 7,4 para el filtro por lo que hay un total de 15 ml de tampón en el tubo de 50 ml. </li><li> Añadir 6 perlas de tungsteno limpias (3 mm de diámetro) a cada tubo 50 ml, cubrir el tubo con Parafilm, y agitar vigorosamente durante 20 min (50 ml adaptador de utilizar tubos de vórtice). Si multIPLE filtros se procesan de una muestra, la transferencia y la piscina todo el homogeneizado en un tubo de 50 ml limpio. Centrifugar los tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células bacterianas de pellets y alícuotas (~ 1 ml alícuotas) en 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Tenga en cuenta que habrá 5 tubos de microcentrífuga por muestra. </li><li> Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 10.000 xg durante 10 min, y eliminar la mayor parte del sobrenadante hasta ~ 200 marca l. </li><li> Almacenar las muestras a -80 ° C, o proceder a extraer el ADN bacteriano mediante el uso de un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante. Durante el uso de extracción de ADN bacteriano o bien PBS o agua como control negativo de extracción, y E. coli como un control positivo de extracción. </li><li> Debido a que el ADN de múltiples tubos se extraen, piscina sub-paralelas alícuotas de la misma muestra en un tubo de 2 ml. A continuación, llevar a cabo una / N precipitación O mediante el uso de una solución compuesta de 0,1volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100%, y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien y guarde las muestras a -80 ° C. </li><li> Centrifugar a velocidad máxima (17.000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar la pella con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo, secar al aire en una cabina de bioseguridad por no más de 5 min y resuspender el pellet de ADN en 34 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Nota: acrilamida lineal ayudará a visualizar sedimento de ADN después de la O / N precipitación. </li><li> Determinar la cantidad de ADN y la calidad utilizando una alta sensibilidad del ensayo de cuantificación de ácidos nucleicos fluorescente y un espectrofotómetro microvolumen, respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales). Nota: Si múltiples muestras se preparan en el momento, un ensayo ultrasensible de ácido nucleico fluorescente para la cuantificación de ADN de doble cadena y con base de placa fluorómetro / espectrofotómetro se puede utilizar en su lugar. </li></ol> 3. Preparación de ADN Biblioteca <ol><li&gt; Normalizar ADN bacteriano genómico extraído de muestras de agua a una concentración de ~ 0,2 ng / l. </li><li> Enzimáticamente fragmento de un nanogramo de ADN bacteriano utilizando un método basado en transposón (tagmentation). Añadir adaptadores e índice secuencias en el ADN fragmentado siguiendo las instrucciones del fabricante. Asunto tagmented muestras a 12 ciclos de PCR como se indica en las instrucciones del fabricante, momento en el que se incorporan los índices de secuenciación. </li></ol> 4. Gel Automatizado Tamaño Selección <ol><li> Saltar paso estándar de limpieza post-PCR se describe en las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales). Tamaño selectas muestras post-PCR directamente utilizando una plataforma de selección de tamaño a base de gel automatizado. <ol><li> Añadir 3,5 l de tampón de carga a cada muestra. </li><li> Siguiendo el protocolo del fabricante, cargar las muestras en la estación de trabajo de la electroforesis, especificando un objetivo de selección de tamaño de 500-800 pb, en un extracto de 300 lvolumen de iones, usando un casete de agarosa prefabricado 1,5%. </li><li> Se concentra el material de salida en bruto (300 l) a 25 l mediante precipitación con etanol. Nota: También puede utilizar la estación de trabajo de electroforesis para automatizar la concentración de un mayor número de muestras a través de la placa de filtro y colector de vacío. <ol><li> Precipitar el volumen de elución en bruto utilizando 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100% y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien, colocar las muestras a -80 ° CO / N. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 30 min. </li><li> Desechar los sobrenadantes y proceder a lavar sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo. </li><li> Centrifugar las muestras de nuevo a 17.000 xg durante 30 min, descartar los sobrenadantes, secar al aire, y finalmente se resuspenden sedimento de ADN en 25 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Opcional) Utilice 1 l de tamaño bibliotecas de ADN seleccionado con la plataforma de selección del tamaño de gel automatizado para hacer un cincodilución -fold utilizando solución tampón Tris-EDTA, pH 8,0. Analizar las bibliotecas utilizando un instrumento de electroforesis capilar a base de chip para analizar la calidad de dsDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5. Biblioteca Normalización y secuenciación <ol><li> Proceda a normalizar las muestras usando perlas de normalización de la biblioteca (incluidas en el kit de preparación de biblioteca basado en transposón) como se describe en la guía de preparación del fabricante. <ol><li> Alternativamente, las bibliotecas dsDNA medir usando un ensayo de cuantificación fluorescente de ácido nucleico de alta sensibilidad, seguido por la puesta en común en relaciones equimolares para llegar a una concentración final de 2 nM dsDNA. Proceder para desnaturalizar las bibliotecas utilizando 10 l de bibliotecas agrupadas y 10 l de 0,2 N NaOH, incubar durante 5 min a TA. Diluir bibliotecas desnaturalizados utilizando tampón de hibridación (incluido con el kit de preparación basado en transposón) a un volumen final de 1 ml y la concentración de 23:05. </li></ol></li><li> Cargue la muestras en una plataforma de secuenciación de próxima generación siguiendo protocolos de secuenciación estándar del fabricante. </li></ol>

<ol>
	<li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks.">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li><li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples.">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li><li>Liles, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li><li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA.">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li><li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system.">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li><li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Choices+for+Library+Prep:+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq.">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501 (2014).</li></ol>

Jared R. Slobodan y Matthew J. Nesbitt tanto tienen acciones de Coastal Genomics, una corporación British Columbia privada que ofrece la tecnología de Ranger.

La presencia de dímeros de adaptador y la agrupación de pequeños tamaños de inserción preferentemente ser secuenciados en las plataformas actuales representan una disminución en los rendimientos utilizables y subutilización de la capacidad del equipo 15. El uso de métodos de batido de talón combinado con un enfoque basado en transposón para preparar bibliotecas puede resultar en más de cizallamiento ADN en comparación con otros métodos de extracción de 4,5. Sin embargo, todos los mét...

Metagenomics involves the sequencing of all the genetic material in a sample to characterize the microbial communities present. It is a complex and expensive process which involves the conversion of extracted nucleic acids into DNA libraries followed by next-generation sequencing. High quality libraries are essential for maximal data output and accurate metagenomics analysis. Environmental samples, such as water samples, often pose significant challenges to generating high quality libraries, due to low amounts of DNA that may also be degraded1-3 and the presence of inhibitors of PCR4-6. 
High quality libraries ideally consist of longer segments of DNA within a narrow range of lengths. In order to maximize the amount of useful data generated per sequencing run, the length of the DNA in the library should be at least as long as the maximum read length of the sequencing method being used. When using a sequencing-by-synthesis technology such as the Illumina MiSeq, the size of the DNA fragments affects the efficiency at which clusters are generated on the flow cell. For instance, when a library contains both shorter and longer DNA fragments, the shorter ones will be over-represented in the sequencing data7,8. In contrast, a library with similarly sized DNA fragments will be proportionally represented in the sequencing data. Many library preparation kits use ligation-based methods to add adapters to the DNA fragments and size selection is necessary to remove adapter dimers that do not contain an insert9,10. There are numerous methods11,12 to achieve this but the one technique that gives the most consistent results is the electrophoretic separation of DNA followed by the recovery of the desired lengths of DNA13,14. This process can be performed manually for a small number of samples, but when faced with processing hundreds of samples, automated solutions are required. The currently available platforms for automated gel size selection are low throughput and new platforms are needed to process large numbers of samples for sequencing. The Ranger Technology can be integrated with existing liquid handling workstations to enable the use of agarose gel electrophoresis for size selection and analytical purposes on a scale that satisfies today&#8217;s high throughput environment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>1400-1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Supor Membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-969</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten carbide beads 3 mm (200)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol 70%</td>
			<td>Jedmon Products</td>
			<td>825751</td>
			<td>Healthcare Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA away</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7010</td>
			<td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water purification system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ZMQS6VF0Y</td>
			<td>Merck Millipore. This system has been discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X PBS pH 7.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E703-1L</td>
			<td>Amresco, Inc., Solon, OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Fisher chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13000-V1-50</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2, 120V (Model G560)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Centrifuge</td>
			<td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td>
			<td>Model J-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13000-V1-24</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 18 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nimbus Select workstation with Ranger Technology</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>92720-01</td>
			<td>Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranger reagent kit</td>
			<td>Coastal Genomics</td>
			<td>CG-10600-150-12-21</td>
			<td>Includes loading buffer and cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (anhydrous)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Greenfield Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear acrylamide (5 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9520</td>
			<td>Ambion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge</td>
			<td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB (250 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>Invitrogen. This product has been discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA reagent</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2011 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA sample preparation kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT index kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq reagent kit v2 (500-cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated gel size selection to improve the quality of next-generation sequencing libraries prepared from environmental water samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

Concentración de ADN, y la Evaluación de la Calidad Las concentraciones de ADN bacteriano oscilaron 0,01 a 0,11 ng ​​/ ml por muestra de agua de los diferentes sitios de la cuenca (Tabla 1). ADN aislado de la fracción bacteriana tenía A 260/280 y 260/230 A proporciones de 01/04 a 01/08 y de 0,3 a 1,6, respectivamente. Aunque algunos de los A 260/230 proporciones eran relativamente bajos, ninguna inhibición aparente s...

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Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

10.4K vistas.  The University of British Columbia. This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries. 